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질문 western - actin
coco  | 2011.08.16 16:56
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: 2.bmp (1.07 MB)


 WB 자주하는 연구원입니다.
 얼마전부터 actin을 붙이면 너무 타고 background도 지저분합니다.
 워싱을 충분히 자주 해줬음에도 불구하고 다른안티바디와
 비교햇을때 actin을 붙인 멤브레인을 현상햇을때 지저분하고 너무 타서
 밴드비교조차안됩니다.
 현재 쓰고 있는 actin 은 SIGMA A5060 을 사용하고
 처음엔 1:10,000 으로 희석하여 사용햇었고 잘 나오다가
 이런현상이 일어나서 1:20,000으로 희석했지만 결과는 모두 같았습니다.
 물론 2차는 한번더 희석해서 사용햇습니다.
 현상시 노출 시간은 actin이 워낙 signal이 강해서 10초이상은 하지 않았습니다.
 3sec, 5sec 해보았지만 계속 타고 지저분하게나오네요..
 
 그리고 멤브레인밑부분쪽엔 까만줄이 나오는게 이건 뭐땜에 생긴걸까요
 혹시나해서 버퍼며 마커며 모두 새로 사용해보았지만
 어떨땐나오고 어떨땐안나오네요..
 사진첨부합니다. 제발 도와주세요

#western
 
#actin
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
엘피스바이오텍  |  2011.08.16    

이런 현상은 둘중의 하나가 원인입니다.

1. Blocking이 잘 않된 경우 : milk의 농도가 정확하더라도 milk의 quality가 떨어지면 이러한 non-specific은 쉽게 생길 수 있습니다. 물론 이는 모든 blocking과정이 정상이라는 가정하에서 입니다만, blocking의 방법이 잘못되었을 경우에도 이러한 현상은 발생합니다.
일반적인 blocking방법은 5% milk/TBST (0.1% Triton X-100)으로 shaking을 하며 1시간.

2. Antibody의 Titer : Antibody의 specificity에 문제가 있거나 또는 titer가 맞질 않는 경우 (일차 이차 항체 모두 해당하는 내용입니다)에 나타나는 전형적인 현상입니다. 요즘은 감도가 높아진 ECL solution이 대세가 되고 있기 때문에 기존에 쓰던 방식대로 항체를 사용하다 보면 background가 비례하여 높아지는 경우가 많습니다.

한가지 더 말씀드리면 정체된 상태에서 항체는 비특이적으로 붙을 가능성이 높아집니다. 가능하면 membrane이 잘 움직일 수 있도록 shaking을 해주어야 하며 wash도 가능한 자주 buffer를 바꿔주며 조금은 과격할 정도로 흔들어 주면서 해줄 필요가 있습니다. 또한 항체도 꼭 blocking solution에 희석하는 것이 좋습니다. 항체가 아주 특이성이 높다면 몰라도 많은 항체들이 그렇지 못하기 때문에 항체를 처리하는 과정중 비특이적으로 붙는 것을 막아줄 필요가 있습니다.

아랫쪽의 까만 줄은 비특이적 단백질들에서 lane간 서로 붙어 형성된 듯이 보입니다.

마지막으로 실험은 요리하는 것과 비슷합니다. 저는 개인적으로 음식만드는 것을 상당히 좋아하는데, 같은 재료로 같은 공간에서 음식을 만들더라도 사람마다 맛에 차이가 있듯이 우리가 하는 실험도 이와 비슷하다고 생각합니다. 어떻게 해야 좋은 맛이 나는지는 좋은 레서피의 확보는 물론 그때그때 얻어지는 작은 경험들이 관건라고 생각합니다.

coco  |  2011.08.17    


 답변감사합니다.
 
 실험과정을 되짚어 본 결과 blocking의 문제는 없는 것같습니다.
 한 membrane에 다른 안티바디를 처리하고 마지막에 actin을 처리하는데,
 다른 안티바디를 처리했을 경우 결과는 상당히 깔끔하고 이쁘게나왓었습니다.
 그런데 유독 actin만 이런 현상이 일어나구요..
 
 궁금한건 안티바디의 titer인데.. 현재 사용하고 있는 actin, ECL 모두 
 수년간 써왔던 제품이라.. 이해가 잘 안가네요..
 그리고 예전엔 actin도 이쁘게 나왓었는데,,


이건 약 2달 전에 실험했던 actin 입니다.
background도 깨끗하고 band도 확실하게 보일 뿐 더러
이때 actin은 skim milk에 1:10,000으로 희석하여 사용하였습니다.

물론 앞에 보여드린 실험도 skim milk에 희석하고 실험과정또한 똑같이했습니다.
도대체 이유가 뭘까요..

올챙이아포콰트로  |  2011.08.17   

film 만 보고 말씀드리기 어렵습니다만.. 
runing gel은 몇%로 만들어 사용하셨는지요.. 비단 anti-body만의 문제는 아닌 것 같습니다. 일상적으로 해오시는데 clear하게 안될 경우에는 gel making 시약을 새로 만드셔서 원초적인 것부터 잡아가시는게 해결하시는데 빠를 것 같습니다..

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