원문에 젤 볼륨에 1 볼륨을 넣으라고 되어 있는데요..버퍼볼륨까지 합쳐서 total volume에 1볼륨의 isopropanol을 처리하신건가요?
wash는 2-3번 정도 반복해서 해주시고 마지막 wash후에 wash buffer를 버리고 빈 컬럼을 최대 스피드로 1-2분정도 돌려서 wash buffer를 완전히 제거해 주세요
그리고 elution은 D.W로 하시는게 ligation할때 더 좋습니다...그리고 elution하기전에 D.W넣고 1-5분정도 실온에 놔두었다가 elution하세요
한가지씩 봅시다.
플라스미드 미니프랩할때 왠만하면 컬럼 하나만 사용해도 충분한 양이 나옵니다.
보통 적게 나올까봐서 culture양도 많이 사용하고 여러 컬럼을 사용하지만 1.5ml culture만 사용해서 매뉴얼대로 하면 충분한 양이 나옵니다.
양이 정 걱정된다면 1.5ml 씩 10개정도 하시던가요.
효소로 DNA를 자르는 이야기는 있는데 벡터인지 인서트(플라스미드에서? or PCR 산물에서)인지 모르겠군요.
그리고 80ul를 잘랐다고 쓰셨는데 80ul안에 몇 ug의 DNA가 있는지는 안적었네요.
벡터가 8kb면 크다면 큰 사이즈입니다.
이것을 double cut할때 두 효소자리가 가깝다면, 그래서 잘려 나오는 조각이 50bp 미만이라면 궂이 제거하려고 하실 필요는 없습니다.
DNA의 부피가 주용한게 아니라 양(ug)이 중요합니다.
젤추출하는 과정에서도 전체 DNA의 양도 언급이 없고 추출할 DNA 밴드의 양도 언급이 없어요.
몇 ug의 DAN를 잘라서 몇 kb짜리와 몇 kb 짜리가 나오는데 그 중 몇 kb짜리를 추출해야한다.
등의 언급이 있어야 ligation할 양이 어느정도 이므로 자르는데 필요한 양이 몇 ug이다라는 계산이 나옵니다.
그냥 무턱대고 추출 효율이 낮다고만 하면 디스커션이 안됩니다.
젤추출 결과 DNA 양이 얼마나 얻어졌다는 설명이 없습니다.
추추량이 얼마인지 모르니 ligation을 벡터 몇 ug, 인서트를 몇 ug 사용했는지 등의 설명이 또한 안됬구요.
트랜스포메숑도, control을 했다는 언급이 없어서 뭐라 말할 수 없습니다.
컴셀의 효율도 예전에 쟀을때하고 직접 실험할때가 다를 수 있습니다.
그래서 control을 같이해서 어느 부분에서 잘못되었는지를 알아야합니다.
그냥 EtOH ppt할때 대개 다 제거됩니다.
CIP처리에만 신경써도 됩니다.
1. 벡터를 두 효소로 자르면 몇개의 조각으로, 어느정도 크기로 잘리는가?
2. miniprep후 플라스미드의 양(ug)은 어느정도인가?
3. 인서트는 플라스미드에서 잘라내는가? PCR로 만드는가?
4. 인서트가 플라스미드 조각이라면 그 플라스미드의 크기는 어느정도인가?
5. 인서트를 가진 플라스미드 어느정도 양(ug)을 잘랐는가?
6. 최종 추출 양은 얼마인가?
7. ligation에 사용하는 벡터의 양(ug)과 insert의 양은(ug) 은 얼마인가?
8. 어떤 control을 사용하였는가?
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narms
(비회원)
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11.08.12 17:53
답글 감사합니다..
우선 isopropanol 볼륨은 말씀대로 잘못이해하고 사용했네요..ㅠㅠ지적해주셔서 감사합니다.
그리고 TA cloning한 DNA를 잘라 다른 vector와 붙이는 작업이구요..(맞는 용어인지 모르겠네요;;)
그니까 insert는 plasmid에서 자른거가 맞는거죠?
miniprep해서 얻은 DNA의 농도는 총 26 ug정도가 되고요..
여기서 효소로 자르면 3kb의 vector(T easy vector)와 약500bp의 insert가 나오게되고, 여기서 저는 isnert를 추출하기위해 gelprep을 합니다.
그리고 8kb정도되는 vector에 insert를 넣을건데요..말씀대로 두 효소자리가 가깝습니다. 확인해보니 잘려나오는 조각이 3bp밖에 안되네요..
근데 두 효소자리가 가까우면 굳이 제거할 필요가 없다는게 무슨말인지 모르겠어요..ㅠㅠ 이 벡터는 효소로 절단하지 않아도 된다는 말인가요??
그리고 젤추출 후에는 (최종 추출양)
insert DNA는 0.5~1.0ug,
vector는 0.5ug (평소에는 25ug정도 나왔는데 kit 바꾸고 이렇게밖에 안나오네요)
ligation할때는 vector 농도가 100ng 이상이 되도록 계산합니다.
가장 최근에 한 실험때는 vector농도는 130ng, insert는 50ng정도의 농도로 ligation하였습니다.
transformation때는 control을 같이 하지 않았습니다..control확인할 생각도 못했네요..ㅠㅠ
벡터에 효소처리없이 임의의 insert도 넣지않고 바로 컴셀에 넣어서 transformation하면 되는건가요? 그리고 여기에 만약 콜로니가 안뜬다면 컴셀에 문제가 있게되는건가요?
질문에 제가 맞게 대답한건지 모르겠네요..ㅠㅠ
miniprep해서 얻은 DNA의 농도가 총 26 ug정도면 아주 좋습니다.
이 플라스미드를 자르면 insert조각이 플라스미드 크기의 1/7 짜리가 나옵니다.
insert 1ug을 얻기 위해서 최소 7ug을 잘라야 한다는 계산이 나옵니다.
벡터를 자를때 두 효소자리의 사이가 3bp라면 어렵습니다.
한 효소가 플라스미드를 자르면 두번째 효소가 자르기 어렵다는 말입니다.
무슨 말인고 하면, 제한효소가 자를 자리를 인지할때, 가령 BamHI이라면 GGATCC가 있으면 될것으로 생각하지만 사실은 NNNNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNN 처럼 효소자리 양쪽에 최소 몇개씩의 염기가 더 있어야 인지하고 자를 수 있다는 의미입니다.
이 추가적인 염기의 수는 효소마다 다르며, NEB 카타로그에 나와 있으니 참고하시면 됩니다.
아마도 이런 이유가 클로닝에 실패한 주된 이유가 될것입니다.
두 효소자리가 가까우면 두 효소에 의해 잘려진 DNA 조각의 크기가 작아서 효소처리 후 phenol extraction/EtOH ppt할때 제거되므로 벡터를 두 효소로 자른 후 gel에서 elution할 필요가 없다는 의미입니다.
ligation할때는 vector 농도가 100ng 이상이 되도록 하는것은 좋습니다.
vector농도 130ng, insert 50ng 를 사용할 경우,
벡터와 인서트의 크기가 각각 8,000bp, 500bp 이므로 인서트에 비해서 벡터가 16배 큽니다.
질량의 비로 벡터 : 인서트 = 16 : 1 이라는 의미입니다.
다시 말하면, 벡터와 인서트를 각각 100ng 씩 사용하면 분자수의 비는 1 : 16 이 됩니다.
인서트 과다입니다.
인서트가 과다하면 인서트들끼리 ligation되서 길다란 concatemer가 만들어지고 정상적인 cloning이 잘 안됩니다.
* ligation시 벡터와 인서트의 비는 분자수의 비이며 ug의 비가 아닙니다.
다시 계산해보죠.
벡터를 100ng을 사용할때 인서트를 25ng을 사용해야 분자수의 비가 [V] : [I] = 1 : 4가 되겠죠.
transformation때는 control은 필수입니다.을
control이 있으면 transformant가 안나왔을때 어느 단계에서 잘못되었는지를 쉽게 파악해서 그 잘못된 단계만 수정하면 되거든요.
control은 다음과같이 하세요.
1. 컴셀만 TF: 컴셀리 오염되었는지 or 항생제가 괜찮은지 확인. colony가 나오면 안됨
2. 클로닝에 사용하는 같은 종류의 plasmid 를 supercoil form으로 같은 양 TF: 컴셀의 효율 확인: 어마어마한 수의 colony가 나와야 정상
3. 효소로 자른 벡터를 같은 양 TF: 안잘린 벡터가 섞여 있는지 확인. colony가 안나와야 함.
4. 3의 벡터를 ligation해서 TF: ligase가 active한지 확인. CIP 처리 안했으므로 colony가 수백-수천개 나와야 정상.
두 효소로 자른 경우, colony가 안나오면 최상, 몇개 수준이면 그나마 양호.
5. 3의 벡터를 CIP처리한것을 동일양 TF: CIP가 active한지 확인. colony가 안나오면 최상, 몇개 수준이면 그나마 양호.
요렇게 5개의 control을 하면 contrrol의 결과에 따라서 벡터가 잘못 준비되었는지, CIP, ligase 등 효소가 inactive한지, 컴셀이나 항생제가 좋은 상태인지 확인이 가능합니다.
* 얼핏 생각에 님의 경우, 벡터가 두 효소로 완전히 잘리지 않은 문제와 인서트를 과다하게 사용한 것이 주 요인으로 보입니다.
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narms
(비회원)
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11.08.16 14:04
감사합니다..정말 도움많이 되었어요
다시 실험해서 문제점을 찾아보겠습니다. 정말 감사합니다!!! (__)