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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 16S rDNA sequence 중에서 특이적 primer를 제작하려면
primer제작초보  |  2005.09.08 00:00
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
universal primer를 이용해서 16S rDNA cloning을 해서 여러 미생물을 찾았는데요.

이런 미생물 중에서 어떤 한 종을 타겟으로 그것만 증폭하는 primer를 제작하려고 합니다.

예를 들어 NCBI assession no.AF425948(Rhodoferax ferrireducens 16S ribosomal RNA gene)인 미생물 sequence 중에서 특이적 primer를 제작하려면 어떻게 해야 하나요?

1 agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcatgc cttacacatg caagtcgaac
61 ggcagcacgg gagcaatcct ggtggcgagt ggcgaacggg tgagtaatat atcggaacgt
121 gcccagtcgt gggggataac gcagcgaaag ctgtgctaat accgcatacg atctctggat
181 gaaagcgggg gactcgcaag ggcctcgcgc gattggagcg gccgatatca gattagctag
241 ttggtggggt aaaagcccac caaggcgacg atctgtagct ggtctgagag gacgaccagc
301 cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaattttgga
361 caatgggcgc aagcctgatc caacaatgcc gcgtgcagga tgaaggcctt cgggttgtaa
421 actgcttttg tacggaacga aacggcctgc cctaatacgg tgggctaatg acggtaccgt
481 aagaataagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt
541 taatcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg caggcggtta tataagacag atgtgaaatc
601 cccgggctca acctgggacc tgcatttgtg actgtatagc tagagtacgg tagaggggga
661 tggaattccg cgtgtagcag tgaaatgcgt agatatgcgg aggaacaccg atggcgaagg
721 caatcccctg gacctgtact gacgctcatg cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag
781 ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg tcaactggtt gttgggtctt cactgactca
841 gtaacgaagc taacgcgtga agttgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttgaaactc
901 aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggatgatgt ggtttaattc gatgcaacgc
961 gaaaaacctt acccaccttt gacatgtacg gaatccttta gagatagagg agtgctcgaa
1021 agagagccgt aacacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt
1081 taagtcccgc aacgagcgca acccttgtca ttagttgcta catttagttg ggcactctaa
1141 tgagactgcc ggtgacaagc cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcct catggccctt
1201 ataggtgggg ctacacacgt catacaatgg ctggtacaaa gggttgccaa cccgcgaggg
1261 ggagctaatc ccacaaagcc agtcgtagtc cggatcgtag tctgcaactc gactacgtga
1321 agtcggaatc gctagtaatc gtggatcaga atgtcacggt gaatacgttc ccgggtcttg
1381 tacacaccgc ccgtcacacc atgggagcgg gttctgccag aagtagttag cctaaccgca
1441 aggagggcga ttaccacggc agggttcgta

어디가 이 미생물의 특이적 부분인지 어떻게 알수 있을까요?
#primer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
한스  |  2005.09.08    
일단 Rhodoferax Genus level 그리고 species level로 16S rDNA alignment를 만들면 어떤 부위가 Rhodoferax ferrireducens에만 존재하는 부위인지 찾을 수 있습니다. 물론 Rhodoferax에 속하지 않는 다른 Genus의 16S rDNA sequence도 포함시키면 어떤 부위가 Rhodoferax에만 존재하는지 아니면 다른 종에도 존재하는 universal site인지 찾아낼 수 있습니다. 이런 방법으로 Genus specific또는 Species specific 부위를 찾아내어 primer를 만들 수 있습니다. 한 종을 대상으로 하려는 것으로 보아 realtime PCR을 하시려는 것 같은데 그렇다면 PCR product사이즈가 200-300bp정도인것이 적당하겠지요.
일단 20bp정도 사이즈의 55도 정도의 anneal temp을 갖는 primer가 좋습니다.
alignment가 이미되어진 file이 RDP에도 제공되어지니 이를 이용해도 되고 ARB에 사용되는 DB를 이용해도 되고 Phydit에 제공되어지는 aligned sequence DB를 이용해도 됩니다.
DB를 이용하면 따로 align할 시간을 들이지 않아도 되고 쉽게 conserved와 non-conserved region을 찾을 수 있습니다.
primer제작 초보  |  2005.09.08    
우선 감사합니다.
그런데 제가 분자생물학쪽을 처음 해보는 초보자입니다.
그래서 기초지식이 많이 부족한데요.
RDP, Phydi홈피는 찾아서 들어가 봤는데 어떻게 해야할지를 모르겠습니다. ^^;
RDP에서 sequence match 에서 Rhodoferax ferrireducens16S rDNA 를 넣으니까 여러개가 나오긴 하는데 거기서 어떻게 conserved와 non-conserved region 부분을 보는지 모르겠습니다.
죄송한데 자세히좀 알려주시면 안될까요?
부탁드립니다.
(^^)(__)
한스  |  2005.09.08    
DNA, RNA 나 protein sequence를 처음 다뤄야하는 분들은 어디서부터 어떻게 시작을 해야하는지 난감한 경우가 대부분입니다. 어디서 따로 가르쳐주는 곳도 없고 그렇다고 메뉴얼이 있는 것도 아니구요. 기본적으로 컴이랑 친하면 쉽게 이해가 가능하지만 그렇지 않다면 더더욱 힘듭니다. 물론 선배들이나 선생님께서 가르쳐주실 수도 있지만 여의치 않을 때도 있습니다. 하지만 하나씩 해결하다보면 나중에는 쉽게 처리하실 수 있을겁니다. 너무 어렵게 생각하진 마세요.

일단 alignment를 자기가 직접 해야하는 경우가 있는데.. 이때는 시퀀스를 alignment하는 프로그램에 입력해줘야 합니다. 이때는 alignment program이 필요하겠지요.
하지만 16S rDNA의 경우에는 이미 alignment가 잘 되어진 DB가 있기 때문에 따로 align 작업을 해주지 않아도 됩니다. 그럼 align되어있는 시퀀스를 다운로드 받아야 하는데..
public DB중에서 RDP가 align되어있는 16S rDNA 시퀀스를 제공합니다. 물론 전체 bacteria나 archaea의 시퀀스를 모두 다운로드 받아서 볼 수도 있지만 이 경우에는 필요한 염기서열만 다운로드 받아서 보면 되겠죠. 프로그램 자체에서 align된 시퀀스를 다운받는 기능을 지원하는 프로그램도 있는데.. 직접 web상에서 download받아서 무료프로그램으로 align된 시퀀스를 보는 방법도 있습니다.
돈많으면 그냥 쉽게 상용프로그램을 사서 이용하는 방법도 있지만 공짜 프로그램도 많은데 굳이 살 필요는 없겠지요. 그럼 간단히 align된 시퀀스를 쉽게 보는 방법에 대해 설명드리겠습니다.
일단 필요한 프로그램은 BioEdit이라는 무료프로그램입니다. 구글에서 찾아보시면 download받을 수 있는 사이트가 검색됩니다.
그다음에 RDP에 갑니다. RDP9는 phylip 기능이 빠져있기 때문에 RDP8로 갑니다.
웹사이트는 <a href=http://rdp8.cme.msu.edu/ target=_blank>http://rdp8.cme.msu.edu/</a> 입니다.
여기에서 온라인 analyses로 들어갑니다. 그 다음 창에서 phylip interface의 파란화살표를 누르면 RDP phylip interface첫화면이 나옵니다. Data set을 small subunit(procaryote)를 선택하고 edit data set 버튼을 누릅니다. 그럼 새창으로 바뀌고 아래쪽에 select RDP sequences 버튼을 누릅니다.
그러면 새로운 창으로 바뀌는데 여기서 원하는 시퀀스를 찾아야 합니다. 시퀀스는 search로 찾을 수도 있고 browse로 찾을 수도 있습니다. 그리고 시퀀스 옆에 초록색 아이콘이 full로(80% 이상) 있는 것을 선택하는 것이 좋습니다. Add 버튼을 누르면 web cache에 자신이 선택한 시퀀스가 add 됩니다. 그리고 선택한 시퀀스 수에 따라 숫자가 올라갑니다. 선택을 할 때 Rhodoferax의 neighbor sequence들을 선택하고 상위로 올라가면서 similarity가 떨어지는 시퀀스도 선택을 합니다. 그래야 원하는 프라이머가 rhodoferax 특이적인지 아닌지 판단할 수 있습니다. 최대한 원하는 만큼 시퀀스를 선택한 다음 다운로드 버튼을 누르면 새로운 창으로 넘어갑니다. Retrieve your file에서 GenBank로 선택하고 download 버튼을 누릅니다.
그럼 선택된 시퀀스들이 GenBank format으로 인터넷 브라우저에 뜹니다.
이후 인터넷브라우저의 file에서 save as로 가서 시퀀스가 있는 창을 새로운 파일이름으로 저장합니다. 저장시 원하는 파일이름을 넣어도 되고 확장자는 안넣어도 되고 GBK로 넣어도 되고 무방합니다.
이제 RDP에서 해야하는 일은 모두 끝이고 BioEdit에서 다운받은 파일을 여는 일만 남았습니다. Bioedit에서 열기로 가서 저장된 파일을 열면 align된 시퀀스정보가 보일겁니다.

이런식으로 하는 방법이 있는가하면 그냥 프로그램내에서 align되어있는 시퀀스들을 선택하여 primer를 만드는 방법도 있습니다. 아래아한글에서 문서를 열고 편집하고 인쇄할 수 있고 또 그문서를 워드나 훈민정음등 다른 프로그램에서 열고 편집할 수 있고 그리고 인터넷 웹사이트에서 이메일 쓰듯이 편집할 수 있는 것처럼 시퀀스 정보도 어느 곳에서나 열고 편집하고 다른 포맷으로 저장이 가능합니다. 더 쉬운 방법을 원하는 사람들이 있기때문에 상용소프트웨어도 판매되는 것이구요. 하...
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