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cheol
(비회원)
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11.08.05 12:33
cDNA를 만들면 blunt이니까 vector에 집어 넣으려면 site가 있어야 하고 blunt 보다는 sticky가 효율이 높기 때문에 XhoI이나 EcoRI site가 포함된 adaptor 사용하여 blunt cDNA에 ligation시키고, 그 다음 그 제한효소들을 이용하여 digest하고 vector에 subclonig. 이 때 주의할 점은 이 때 사용된 vector는 expression vector이므로 발현될 fusion protein과 in-frame될 수 있겠금 adaptor primer를 작성해야 함.
와 답변 감사드려요!!!!
그럼, 어떤 gene 중간에 Xho1이나 EcoR1 이 cut 할 수 있는 site가 있었다면,
subcloning 할 때 잘려서
그 gene full-length 는 vector 에 들어가지 못하는게 맞나요?
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cheol
(비회원)
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11.08.05 15:19
이론적으로 합성된 cDNA에 Xho나 Eco가 있으면 다 잘려 버리죠. 결국 digestion 할때 selection되어 subcloning이 안되고 결국 cloning efficiency가 확 떨어집니다. 재수없으면 자기가 찾고자 하는 cDNA를 cloning하지 못할 수 있지 않을까요? 그러나 분자생물학적으로 그러한 문제점을 극복할 수 있을 테크닉이 있지 않을까 생각됩니다. 예로 cDNA 만들때 그러한 site를 blocking 한다던지 또는 그 제한효소를 적게 사용하여 partial digestion한다던지.... 등등. pACT vector는 지금 하버드에서 일하는 Stephen J. Elledge가 개발해 지금 Clontech에서 판권을 가지고 있을 겁니다. 그 회사에서 나오는 매뉴얼 보면 자세히 나와 있지 않을까요?
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cheol
(비회원)
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11.08.05 15:29
아! 그리고 pACT vector를 이용하여 자기 단백질과 결합하는 단백질 유전자를 찾는 것이기 때문에 full length를 cloning 안해도 되지요. 일반적으로 자기 단백질과 결합하는 단백질은 상대적으로 적은 부위만 이용하여 다른 단백질과 결합하니까요. 일단 pACT vector library를 이용하여 cDNA를 cloning하면, 그 것을 이용하여 probe로 만든다음 다른 보다 나은 cDNA library를 스크리닝을 하여 full-length를 찾으면 됩니다. 불행히도 자기 단백질과 결합하는 다른 단백질 부위의 cDNA에 Xho나 Eco가 있으면 반드시 그 문제점을 극복하고 pACT vector library를 스크리닝해야 할 것으로 생각됩니다.
그렇군요~!!
자세한 답변 감사드립니다.
사실은 제가 저 library 를 template로 cloning 을 하려고 했더니
전체 size는 맞는 것 같지만 full-length가 아닌 것 같아서요..
답변 정말 감사드립니다~!!
어떻게 라이브러리 만드는건지, 이번기회에 자세히 알게 되었네요 ^^
보통 cDNA 합성할 때 5-methyl dCTP를 사용합니다.