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 전체 > Molecular Biology-Protein > Pull-down Assays
조회 6472  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 protein-protein interaction 측정 방법
data맨  | 2011.02.21 09:47
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)

실험 디지인 중에....
실험 방법..아이디어가 궁금하여 질문드립니다.

제가 하고픈 실험은
2개의 단백질이 서로 interaction이 된다는 것을 이미 알고 있는 것
(다른 종에서의 보고된 단백질 1-2)
을 in vitro 에서 각각을 정제하여 interaction 정도를 확인해 보고 싶습니다.

제가 선행 실험을 해 본것은....
(제가 아는 방법은 pull down 밖에 없으니....;;)
하나의 단백질에 tag를 달고... 다른 단백질은 tag가 없는 상태에서
2개를 pull down 했을때 결합하는 것을 확인하였습니다.

또한 함께 키어서 (하나는 tag 있게, 하나는 tag없게...) 같이 정제를 하면...
기특하게도~ 잘 complex를 이루어 정제가 되더군요!ㅎㅎ

여기까지가 기초적인 실험 과정이었습니다.

앞으로 추가적으로 심도있게 해봐야 될 부분은...
이러한 결합을 이루는 두 단백질이...
서로 유사한 것이 2개씩 존재하고 있다네요.....

그래서 각각을 정제해서... 서로 cross interaction이 되는 지를 파악해 보려합니다.
(물론 위의 앞서 정제해서 pull down하는 방식으로 서로 cross가 되는것은 확인했습니다.)

문제는...
이것들이 얼만큼의 affinity... 서로 얼마나 강하게 interaction되는 가를
측정해 보고 싶은데...
그 방법을!! 잘 모르겠습니다.

단백질-단백질이 서로 얼만큼의 interaction이 되는지를 data 수치화 시켜.....
비교할 실험 디자인을 어떻게 하면 좋을까요??

혹~ 알고 계신분이거나...
단순하게라도 아이디어를 좀 주십시요~~^^!
(부탁 드리겠습니다. 꾸벅~^^;)

#protein interaction
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리TX  |  2011.02.21   

affinity를 알고 싶다면, Kd (dissociation constant)를 구하셔야 합니다.
Kd 측정중 가장 간단한 방법은 ELISA based protein interaction 방법입니다.
그런데 이 실험에서 구한 Kd는 실험방법상 정확한 Kd가 아닙니다. (apparent Kd 라고 부릅니다)
정확한 Kd (true Kd이라 부릅니다)를 구하는 방법중 하나는 SPR을 이용한 방법이 있습니다 (Biacore 기기를 이용합니다). Biacore를 쓰면 속도상수를 구해서 Kd를 측정하는 방식이기 떄문에 가장 정확한 결과라고 생각됩니다. Biacore 기기가 상당히 고가(?)인데, 의뢰해서 측정해주는 곳도 있으니 참조하시길 바랍니다..

답변자  |  2011.02.21    

VP-ITC라는 장비도 protein-protein interaction을 확인 할 수 있는 장비입니다.

두 단백질 사이의 binding 수와 ka 등을 알수 있습니다. kd는 1/ka로 계산하면 되기때문에 이장비로도 충분히 알 수 있을 것이라고 생각합니다.

질문자  |  2011.02.21    

답변 해주신 두분의 댓글 감사드립니다.
역시 장비를 사용해 측정해야 되겠네요~
일단 저러한 방법으로 data가 제시된 references논문을 찾아봐야 겠습니다.
(다시 한번 감사드립니다~ 꾸벅~^^;)

알Sun007  |  2011.02.23   

두 단백질이 있다면 하나로 IP를 하고난 후 다른 하나로 western을 하면 두 단백질이 interation한다는 것을 알 수 있습니다. IP를 하면 band가 두개 뜨겠죠 (antibody band 제외). 이때 band를 각각 얻어서 Protein을 얻어 abs를 재어 어느 정도 binding하는지 미루어 짐작할 수도 있습니다. 

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