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질문 MC3T3-E1 (pre-osteoblast) 분화실험 중 궁금한 점이 있습니다.
cell초보  | 2011.01.24 17:01
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
BRIC 회원님들 안녕하세요?

cell 실험을 처음 진행하면서 BRIC 사이트를 많이 참고하고 있습니다. 모든 실험이 처음이라

어려운 점이 많습니다. 그래서 이렇게 cell 실험 초보자로서 질문드려보고자 합니다..

제가 현재 MC3T3-E1 (subclone 4 - ATCC사 구매)을 분화(differentiation)시키고자 실험을 진행

하고 있습니다.  문헌조사를 통해 다음과 같이 배양액을 제조하고 분화유도제도 첨가하였습니다.

배양액: alpha-MEM (10% HI-FBS + 1% P/S 첨가)
분화유도제: L-ascorbic acid 50 ug/ml, beta-glycerophosphate 2 mM

분화유도제는 매번 배양액을 교체해줄때마다 새로 첨가해주었습니다.

cell은 passage number가 14인 것으로 사용했습니다.

35mm well에 cell을 적정농도(10^4~10^5 cells/ml)로 seeding한 후에 3일이 지나서 (이 때 cell이

거의 confluent state에 이릅니다.) 분화유도제를 첨가한 배양액으로 교체해주었습니다.

배양액은 2~3일에 한번씩 교체해주었습니다.

그런데 문제는, seeding 후 10일 정도 되었을 때 phase contrast 현미경으로 관찰해보면 꽉 찬

cell들 사이에서 작은 물방울이 뭉쳐있는 (주변분들에게 문의해보니 지방세포(adipocyte)와 흡사

하다고 합니다.) cell들이 군집을 이루어 well 군데군데 생성되는 것을 볼 수 있습니다.

MC3T3-E1 cell이 pre-osteoblast cell인데 어떻게 이러한 cell들이 생성될 수 있는지 궁금합니다.  
분화시킬 때 사용한 조건이 잘못된 것인지 아니면 제가 다룬 cell의 passage가 좀 오래되어서

그런 것인지 궁금합니다. 그리고 MC3T3-E1 cell이 osteoblast로 분화되면 현미경으로 관찰될

정도로 cell phenotype의 변화가 있는지도 알고 싶습니다. 
#MC3T3-E1
 
#differentiation
 
#osteoblast
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
..  |  2011.01.24    
osteoblast가 분화 10일째라면 mineralized nodule이 아닐까 생각되는데요.
사진이 없어서 정확하게는 모르겠지만..
alizarin red staining해보세요. 붉은 반점이 보인다면 석회화된 결절이 맞습니다.
알핑크팬더  |  2011.01.25   

저도 같은 셀 라인으로 실험하고 있는데 물방울이 뭉쳐있는 현상은 없었구요, passage 40넘은것도 키워봤는데 그런 현상은 이제껏 못봤습니다.
혹시 maintaining 하실 때는 without ascorbic acid media를 사용하시는지??

분화가 제대로 되면 셀 morphology가 눈에 뛸 정도로 변합니다. cell들이 유기적으로 길쭉 길죽해지죠. 일반 growth medium( without ascorbic acid) 와 분화 medium을 처리하면서 비교해 보세요. 5일째만 되도 morphology 변화를 현미경 상으로 알 수 있어요.

cell초보  |  2011.01.25    
답변 감사드립니다.^^

제가 지금 보니 ascorbic acid가 포함된 alpha-MEM을 사용하고 있었군요;;;

말씀해주신대로 ascorbic acid가 없는 alpha-MEM에서 어느정도 성장시킨 후 분화유도제를 첨가

하여 분화시켜봐야하겠습니다.
..  |  2012.01.17    

cell number도 늘려보세요
seeding 할때 2x 10^5 정도로..ㅎ
bmp2 를 처리하면(100ng/lm) 전 6.5 day 에 alizarin red stain으로 확인합니다.
뭐 2.5~3day에 alp stain을 하기도 하지요

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