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지나가다
(비회원)
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11.01.18 18:03
아직도 CsCl 밀도구배법을 이용하여 DNA 분리하시는 분이 있군요...
무슨 목적으로 그런 방법을 쓰시는지 궁금해지네요. 요즘에는 kit로 뽑아도 CsCl 법으로 뽑은 DNA의 purity는 대부분 나오는걸로 아는데... 굳이?
그래도 질문이니까...
밀도구배는 말그대로 CsCl을 녹인 용액을 초고속 원심분리를 하게되면 아래쪽부터 밀도가 높고 차츰차츰 위로 갈수록 밀도가 낮아지게 되는것으로서 DNA를 같이 섞어주게되면 DNA가 가지는 고유의 밀도와 같은 CsCl 용액부분에 DNA가 띠 형태로 있게됩니다. 여기에는 EtBr이 들어가야 그 띠를 확인할수 있습니다. 흰띠라는게 어떤건지는 모르겠고 DNA는 양이 많아서 EtBr이 많이 끼어들어간경우 육안으로도 약하게 붉은 색으로 보이기는 하지만 뽑을때에는 UV를 쪼여서 band를 보면서 빼내야합니다. 이 작업후에 CsCl을 없애기위해 투석도 해야하고 농축도 해야하고... 번거롭기 그지없습니다. 이제는 거의 안쓰는 방법으로 아는데 그걸 왜 하시려고 그러시나요? 다시금 궁금하군요...
CsCl 법은 plasmid DNA에 gDNA가 많이 섞였을 경우에 plasmid를 gDNA에서 분리하는데는 아직도 최선의 방법입니다.
CsCl법은 DNA에 CsCl와 EtBr을 녹여서 초원심분리를 합니다.
그러면 CsCl 농도구배가 만들어지고 CsCl와 결합한 DNA가 자기밀도에 맞는 높이에 머물러서 밴드형태로 보입니다.
EtBr을 넣지 않으면 plamid와 gDNA가 분리되지 않습니다.
원심분리 후 띠가 보이는것은 DNA 띠입니다.
이 띠를 따내면 DNA와 CsCl (EtBr을 섞었다면 EtBr도 포함) 입니다.
dialysis를 하거나 5배 희석해서 EtOH ppt를 해서 CsCl를 제거해줘야 합니다.
EtBr을 넣었을 경우는 동일 부피의 CsCl로 saturation시킨 IPA나 n-butanol로 여러번 추출해서 EtBr을 완전히 제거해야 합니다.
Transfection을 엄청 많이 하는 1인 입니다.
아직도 최선의 방법이라는데 공감합니다.
mg단위의 플라스미드 DNA를 얻을 수 있는 가장 쉬운 방법이라 생각합니다...
힌띠는 degraded 단백질일테고요.. 양이 많으면 EtBr로 염색된 플라스미드 DNA가 가시광선하에서도 보이지만, 양이 적으면 UV 램프 하에서만 플라스미드 DNA가 보입니다.. EtBr로 염색된 플라스미드 DNA 색깔은 아시죠??