37도시에서 induction할때는 보통 1-4시간 정도 합니다.
(물론 유전자 종류에 따라서 이 시간은 더 길어질 수 있습니다)
10도시는 대장균이 거의 자라지 않는 정도의 온도입니다.
그말은 대장균 내 효소들이 활성을 보이기 어려운 온도라는 의미입니다.
경우에 따라 다르겠지만 12-24시간은 induction해야 됩니다.
10도시에서 배양하면서 12시간에서 한번, 18시간에서 한번, 24시간에서 한번 ... 이런식으로 시료를 취해서 젤에 걸어봐야 알 수 있습니다.
그런데 4도시는 세균을 단기 보관하는 온도입니다.
induction이 힘든 온도입니다.
답변 감사드립니다..
4도시 induction은 제가 이곳 리플에서 얼핏 본 것 같아서요.. 그 분이 하셨다는건 아닌데 하시는걸 보았다는 리플을 본거 같아서 해보려고요..
일단 하는데 까지 해봐야죠... 해도해도 안되면 refolding하려고 합니다.ㅠㅠ
일반적인 조건에서 발현량은 어떤지요?
만약 발현량은 많다면, 일단 IPTG 농도를 최대한 줄이고, 발현시간도 아주 짧게 하는것이 좋습니다. 온도는 10도 이하에서는 발현시간이 길어지기 때문에 비추입니다...
그냥 실온에서 하는 것이 좋습니다.
예)
IPTG : 0.01 mM
OD = 0.8 (basal level expression이 보이면 더 낮추세요. 0.4~0.5 정도..)
temp = room temp
time : 30분, 60분, 또는 최대 90분...
꼭 성공하시길 바랍니다....
예)
IPTG : 0.01 mM
OD = 0.8 (basal level expression이 보이면 더 낮추세요. 0.4~0.5 정도..)
temp = room temp
time : 30분, 60분, 또는 최대 90분...
답변 감사드립니다.
expression level은 좋은 편입니다. 아무래도 4도시는 무리일 듯 싶고요, 10도시와 15도시를 해보려고 합니다.
R.T를 20~22도시라고 보고, IPTG역시 0.01mM로도 진행을 해보아야 겠네요..
도움이 많이 됐습니다^^
다시한번 답변 감사드립니다.
단백질 정제를 주로했던 사람으로써...
위의 답글중에 궁금증이 있어 추가질문 드려봅니다.
왜 발현 시간을 줄여야 soluble에 더 좋다고 하는지에 대한 부분입니다.
발현할때, intduction 시기에 온도를 낮추고, IPTG농도를 줄이는 이유는
protein의 발현,합성 속도를 저하시켜...
최대한 천천히 합성되면서 대장균 입장에서
외래의 외부 단백질을 억지로(?)합성하면서.....자신한테 이득이 없으니.....
indoluble형태로 만들어 버리는 것이라 생각되기에..
최대한 합성을 천천히 시키기 위해 온도 낮추고, IPTG농도 또한 줄이는 것으로
저는 알고 있습니다.
그래서 온도를 낮추어 culture할때에는...
어쩔수 없이 발현 시간을 온도를 낮춘만큼....더 오래 culture하고 있습니다.
그리고 또 어떠한 경우에서는
과하게 좀 오래 키운 상태에서 soluble로 갔던 case도 있구요..
(물론 그 이유는 모르겠습니다....!!;;)
그래서 답글중에 발현 후 culture 시간을 줄이라는 부분에 대해 질문 드려봅니다!!
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그리고 원 질문을 하신분께
제가 드리고자 하는 코멘트는...
1. 우선 발현 시스템을 바꿔보는 것은 어떨까요?
현재 어떤 fusion tag를 사용했는지 명시되어 있지 않기에..잘 모르겠으나...
expression vector를 다양하게 test해 보는것도 때론 결과가 달라집니다.
(ex) 같은 HIS-tag를 사용해도
pQE 계열.. pProEx-Ht 계열.. pET 계열....
다 promoter 종류가 달라서...(하지만 이건 주로 발현에 더 영향을 주겠지만...;;)
HIS 대신에 GST tag를 사용해도.. 결과가 조금 긍정적인 case가 있으며
제 경험상 MBP (maltose binding tag는 solubility는 거의 100% 효과를 주는!!)
하지만 정제 affinity ,purity..tag 제거 등의 어려움이 있어 기피되는 tag 입니다.
2. 단백질의 특성에 대한 연구를 조금 해볼 필요가 있습니다.
혹...cofactor를 culture조건에 첨가해보는것....
어떤 특정 미량 원소의 첨가......
(가끔 요런게 제대로 단백질의 folding을 도와 정제까지 잘되는 case 있습니다!)
3. 마지막으로...refolding
저는 지금껏 단 한번도 제 실험에 final 과정까지 성공한적이 없어....
솔직히 비추천 입니다.
실험 성공하시길 바랍니다~~~~~~~~^^!
댓글 적고 나서 추가로 생각되는 점이 더 있어 추가합니다~ㅎ
1. BL21(DE3) 이외의 다른 strain competant cell을 test 해 보시는 것을 어떨까요?
2. 혹 condon usage 확인 해 보셨는지요?
어떤 source의 단백질인지 모르겠으나...무조건 대장균이 모든 외래 단백질을..
다 제대로 잘 발현 시킬수는 없으니......!!!
한번쯤 rare codon 확인이 필요합니다. (특히나 human 단백질일 경우에는!!)
3. 실험 조건을 조금더... 노가다(?)를 해야 합니다.
IPTG 조건 / 온도/ culture 시간... 변수가 많아질수록...
실험 조건이 많아져.... 막상 test하기 어려움이 있습니다.
한번의 실험이 제대로된 결과가 아닌 효과가 보이기도 하구요........
위의 마지막 test라고 적어놓은 조건이...조금은 그냥 딱! 선정된 조건으로 보여서요~
그럼~ good luck~~!!
발현 하려는 단백질이 독성으로 작용할 경우, 질펀하게 키워서 짧은 시간에 발현시켜보는 거죠,
발현하는 호스트한테 독으로 작용하는 단백질의 경우 대부분 이놈이 쓰레기 취급을해서
inclusion body로 분류해 버리 거든요.
그래서 시간을 짧게해보는 경우가 있습니다.
근데 그렇게 재미는 보지 못합니다.
단백질이 처음 발현됬을때는 soluble하다가, 시간이 지나면서 insoluble해지는 경우라면,
발현시간을 짧게 하는 것이 좋을것이라고 생각됩니다. -.-;
물론 저온에서는 단백질 발현속도를 늦춰서, 단백질 folding을 천천히 진행시키는것도 좋은 방법입니다...
모두들 감사드려요.. 제 질문에 이렇게 관심가져주셔서 감사합니다.
큰 도움이 됐습니다. ^^
다시한번 감사드립니다^^
모두 하시는 실험 성공하세요~~~~