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pi님께.
(비회원)
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06.09.12 17:31
우선 왜 실험을 하려고 하시는지 목적이 분명치 않으신 것 같네요.
보통 PI로 염색을 하고 FACS로 분석하려고 하는 것은,
nucleic acid를 염색하여 DNA의 fragmentation을 보아 apoptosis여부를 분석한다던지, cell cycle 변화를 본다는 목적이 있을 때 입니다.
님께서는 아마도 독성물질을 처리하여 Apoptosis가 일어나는가를 보려고 하시는 것 같다고 생각드는데 맞나요? (아님 어쩔 수 없고요..)
PI 염색을 하여 FACS를 찍어서 나오는 피크 두개는 정상적인 것이고 별 의미가 없습니다. 각각 왼쪽 것은 2n, 오른쪽 것은 4n으로 핵상을 나타내는 것이니까요. 이 경우 님께서 신경 쓰셔야 할 것은 2n의 왼쪽 부분의 %가 어떤 변화가 있는가를 보셔야 합니다. 처음 실험하시는 거라고 하셔서 조금 썼는데 아마 이해 안되실 수도 있어요.
처음 일수록 이런 곳에 질문하셔서 쉽게 알려고 하지 마시고, 원리를 알수 있도록 하시는게 좋다고 생각해요. Flow cytometry에 대한 책은 얼마든지 많이 있으니까요.
참, 70% EtOH를 처리하는 것은 고정과 permeablization해주기 위해서 PI에서 꼭 해줘야 합니다. 그럼 이만..
아하~ 답변감사드려요~ ^^
이것저것 찾아봤는데 전혀 실마리를 잡을수 없더라구요,,,ㅋ
Flow cytometry 에대한 책을 찾아보면 되는군요,,,
pi staining이 주인공이라 주인공쪽에서만 찾으려 애썻네요...^^
제가 처리한 compound는 원래 약효과를 기대하지만 고농도에선 독성을 띨것이라 생각하여 이실험을 진행하고 있습니다^^
조금만 더 질문을 하면여~~ control과 비교해서 shift가 일어나지 않고 피크의 높낮이만바뀌게 되는건가요? 다른 논문을 찾아봤는데.. 그런거 같아서..^^
글구 제가 막 찾아봤는데 pi는 dead cell만 투과하여 염색이 된다길래 이 이론과 프로토콜들이 이해가 잘 안되더라구요~^^ 그래서 살아있는 세포는 염색이 안되고 죽은세포나 죽어가는 세포만 염색시켜 보는거라 생각했었는데..^^
전그럼 Flow cytometry 에대한 책을 찾아보러 가볼께영^^
항상 행복하세요~^^
님께서 원하시는 FACS 분석은 Apoptotic 또는 nectotic cell을 관찰하기 위한것 같네요.
이럴땐 EtOH를 처리 하지 않습니다.
일반적으로 cell death에서 세포가 PI에 염색이 된다는 것은 necrosis를 의미하는것입니다. 따라서 PI 의 염색여부에따라 Apop 과 necro를 구분하게되는것이죠
따라서 님의 경우 EtOH를 처리 할경우 모든 cell의 membrane 이 망가져 permeablity 가 증가하기 때문에 모든 cell이 염색이 되어버리죠.
그러므로 님의 경우는 처리 하지 않고 실험하시는게 정확한 방법인것 같습니다.
EtOH를 처리하는경우는 위의 님이 설명하신것 처럼 cell cycle등을 확인할때 사용하는 방법입니다. (보다 쉽게 DNA 를 염색하기 위하여 cell의 permeablity를 증가시키는것)
그럼 좋은 결과 있으시길...이상 허접이었습니다. ㅡ.ㅡ
저도 EtOH가 cell fixation 용도라는것은 알고 있지만 저의 경우는 Apop cell을 sorting 해서 gDNA를 회수하는 실험을 진행중인데...EtOH를 사용하지 않고 있거든요.
fixation 과정이 있는거랑 없는거랑 어떤차이가 있나요?
크림슨님 답변좀...^^
참 그리고 Apoptosis와 Necrosis control cell 을 만들경우 5% & 10 % EtOH로 각각 30분정도 incubation 시키는 방법이 있는데...이거랑 70 % 냉장 30분이랑 cell에는 어떤 차이가 나는건가요? 서로 effect 가 다른건가요?
"nucleic acid를 염색하여 DNA의 fragmentation을 보아 apoptosis여부를 분석한다던지" 이것은 어떻게 볼수있는건가요? apoptosis 피크가 점점더 왼쪽으로 가는 피크가 생기는게 맞나요?? DNA가 fragmentaion으로 인해 DNA 사이즈가 작아져서....?
도서관에 갔더니 거의 대부분의 책이 대출중이라 겨우 두권 건져왔네여,..ㅠㅠ
너무 많은걸 배우게 해주셔서 감사해요~^^