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pET32에도 a,b,c type이 있는데 b type을 제외하고는 타겟 단백에 His-tag이 없게 됩니다.
타겟에 stop codon을 넣으셨다면 이마져도 없구요.
따라서 정제후에 트롬빈으로 잘라서 다시 NTA 에 걸면 Trx tag만을 분리할 수 있습니다.
저는 pET32b를 사용하여 target과 Trx에 모두 His-tag이 붙어있습니다.
그래서 이 둘을 분리할 방법을 알고 싶어서요..ㅜㅜ
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이제는외부인
(비회원)
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10.12.10 13:06
target 단백질에 stopcodon을 넣지 않으셨나 보네요 ;;;
게다가 32b고;;
실험실에 다른 32 vector가 있으면 subcloning하셔도 좋고,
아니면 마지막에 stopcodon을 point mutation시켜서 만들어 주시면 될 것 같은데요~
subcloning이나 point mutation이나 실험실에서 조금더 익숙한 방법을 선택하여 정제가 쉬운 상태로 단백질을 발현시키는 것이 좋을 것 같습니다.
아무리 여러 방법, 여러 컬럼들로 정제를 하여 꽤 높은 순도를 가지는 단백질을 얻는다고 하더라도 정제 step과 시간이 길어질수록 단백질의 활성은 생각보다는 급격히 떨어지더라구요
초기단계 (?) 어쩌면 여기까지 오래 걸리셨을지도 모르겠지만 ;;;
조금만 더 애쓰셔서 .. (vector를 바꾸든 mutation을 하든지요..) 정제가 잘되는 상태로 단백질을 얻어내심이 좋을것 같습니다
이제는 실험실에서 나왔지만, 예전에 온갖 vector와 온갖 방법들로 soluble한 단백질 많이~;; 얻으려고 참 애썼던 사람인지라 한마디 적고 갑니다!
좋은 결과 있으시길 빌께요 ^-^
답변 감사합니다.
한 가지만 더 물어보고 싶은데.. 아시는 분들의 답변 부탁드립니다.
그럼 Trx가 있는 pET32나 GST가 있는 pET41과 같은 vector를 이용하여 재조합 단백질을 만들경우 정제까지 완료한 후 enzyme으로 Trx와 GST를 잘라준 후 다시 정제하는 과정을 꼭 거쳐야하나요?
아니면 단백질에 따라 Trx, GST를 없애지 않아도 항원반응이 그대로 나타나는 경우가 있나요?
답변 기다립니다~~
GST나 Trx가 타겟 단백질에 직접적으로 관여를 하지 않는다면 잘라낸 다음에 분리를 하지 않아도 assay는 가능합니다만... 충분한 control sample이 있어야 신뢰가 가는 데이터가 되겠지요.
답은 영향을 줄수도 있고 아닐수도 있다입니다.