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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 RNA degradation 전기영동 (그림첨부) 질문드립니다.
enigma  | 2010.12.02 07:55
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: RNA 전기영동.jpg (19 KB)
이미지 첨부파일
안녕하세요? 

게시판을 통해 RNA degradation 전기영동 관련 글을 읽어보았는데, 

저와 똑같은 case가 없어 고민끝에 글을 올립니다. 

mice skeletal muscle이고, Trizol을 사용하여, 분리하였습니다. (제가 직접하지 않았고, 저는 PCR만 돌렸네요. 조직 제거후 바로 분리했는지 어떻게 했는지 전임자가 없어서 확인이 불가능합니다. ㅠ.ㅠ) 

나노드랍으로 RNA ratio와 농도를 측정하였을때는, 대부분 2.0 (DEPC 사용)즈음에 고농도의 RNA를 얻었습니다. 

하지만, Realtime RT-PCR을 돌렸을때, GAPDH를 비롯한 모든 gene들이 전혀 증폭되지 않았고, 

(=모든 샘플과 NTC가 거의 같은 수준)

Thermocycle를 이용해, 같은 양의 cDNA와 같은 프라이머를 사용했을 때, 

오직 GAPDH만 밴드가 나오네요. 

그래서 혹시 모를 degradation을 확인하기 위해, 

1.2%agarose gel (70V, 1시간, 2Log ladder, 1X TAE buffer)을 돌렸더니,

비록 사이즈가 다르긴 하지만 28s (~4.7kb), 18s (1.9kb)로 여겨지는 두개의 밴드가 보이고,

5.8s 혹은 알수 없는 세번째 밴드가 너무나 선명하게 나오네요. 

밴드가 보이긴 하나 많이 선명하지 않고(?), 2:1의 비율이 아니며, 세번째 밴드의 존재때문에 

RNA 샘플이 degrade되어서, gene amplification 이 안 일어난다고 보는게 맞을까요? 

불쌍한 공대생에게 조언부탁드립니다. 감사합니다.
#RNA
 
#degradation
 
#전기영동
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리세오  |  2010.12.03   
일단, 타켓 gene의 밴드가 일반 피시알에서 잘 되는지 확인해 보세요. 
프라이머를 바꾸어 보시던지 아니면 피시알 컨디션을 바꾸어 보시던지 해서요.

컨디션을 찾은 다음, 추후 실험을 해보세요.
알enigma  |  2010.12.04   
안녕하세요, 세오님. 조언 감사합니다. ^^
일단 primer sequence는 positive control 확인한 결과, 이상이 없는 사용가능한 프라이머 입니다. 그리고 모든 cycle 셋업과 reagent는 확실히 사용가능하고 이미 최적화 되어 있는 프로토콜인데 어떻게 해야할 지 모르겠네요.  

그런데 Realtime RT-PCR을 돌리고, 전기영동으로 확인할 결과는, 
GAPDH를 포함한 모든 gene of interest가 전혀 증폭되지 않았습니다.
(NTC와 모든 샘플간의 차이가 없네요.) 또한 전기영동을 하여, pcr product를 확인했을 때도,
당연하겠지만 밴드가 전혀 나타나지 않습니다. 

재밌는게, thermocycler로 conventional PCR를 돌리면, GAPDH는 그래도 나온다는 거네요. ㅠ.ㅠ
그래서 원인이 불분명하기에, RNA integrity를 위해 젤을 돌렸는데, 
결과분석이 약간 애매하네요. 
그림과 같이, 2개의 밴드가 나오지만, 2:1 이 보여지지 않았고, 밴드가 smear해졌기에
어느 정도는 degrade 되었다는게 확실하지만, 세번째 5.8s인지 깨진 RNA인지 
어떻게 생각해야할 지가 배경지식이 부족해서 해석을 못하고 있네요. ㅠ.ㅠ


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