실험 Q&A Laboratory Animals > Blood
PBMC 와 cell count 에 대한 질문입니다.
레벨1 cjswo
저희 실험실에서 EDTA whole blood에서 PBMC를 분리하여 동결보관하는데요..
PBMC는 manual로 분리하고 있습니다.
전혈을 원심분리한 뒤 buffy coat를 따서 RBC lysis buffer (저희는 ammonium chloride를 사용하고 있습니다.)로 RBC를 lysis 시킨 뒤, washing 하고 마지막에 PBS를 넣습니다. 이상태로 -70도에 동결보관하고 있습니다.
얼마전 교수님께서 이렇게 보관하던 PBMC로 실험하시겠다고(아마 FISH나 squencing을 하시려던것 같습니다.) sample을 가져가셨는데 며칠뒤에 cell 이 다 깨져서 하나도 안보인다고...direct로 하면 완전 clumping 심하고.. dilution하면 하나도 안보이고...웬만하면 조금은 cell 이 보이는데 완전히 안보인다고 하셨습니다..ㅠㅠ
제가 여기저기 알아보니 PBMC를 분리하는 과정에서 쓰는 RBC lysis buffer 나 PBS가 세포에 stress가 되어 cell 이 잘 죽고, PBMC는 해동과정에서 clumping이 잘되어 해동시에 온도나 시간도 잘 맞춰야 하고 DNase를 비롯한 여러 reagent를 첨가하고 centrifugation과정도 거쳐야 하는 등 주의를 기울여야 한다고 들었는데 무엇이 문제일까요??
저희는 sampling 할 때 다른 첨가물이나 부수적인 과정없이 그냥 단순하게 PBMC를 분리해서 얼리는데 DNA extraction 할 때는 문제가 없어보이는데 DNA 분리에는 사용할 수 있을까요??
선배님들의 도움 부탁드립니다.ㅠㅠ
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