실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
EMSA를 하고 있습니다..ㅠㅠ
레벨1 ㅠㅠ
A.Plan binding Reactions
Component |
Final Amount |
Control Reactions | ||
#1 |
#2 |
#3 | ||
Ultrapure water |
-- |
12ul |
11ul |
9ul |
10x Binding Buffer |
1X |
2ul |
2ul |
2ul |
50% Glycerol |
2.5% |
1ul |
1ul |
1ul |
100mM MgCl2 |
5mM |
1ul |
1ul |
1ul |
1ug/ul Poly(dI∙dC) |
50ng/ul |
1ul |
1ul |
1ul |
1% NP-40 |
0.05% |
1ul |
1ul |
1ul |
Unlabeled EBNA DNA |
4pmol |
-- |
-- |
2ul |
EBNA extract |
1Unit |
-- |
1ul |
1ul |
Biotin-ENBA DNA |
20fmol |
2ul |
2ul |
2ul |
Total Volume |
-- |
20ul |
20ul |
20ul |
Component |
Final Amount |
Sample volume |
Ultrapure water |
-- |
10ul |
10x Binding Buffer |
1X |
2ul |
1ug/ul Poly(dI∙dC) |
50ng/ul |
1ul |
Optional : 50% Glycerol |
|
|
Optional : 1% NP-40 |
|
|
Optional : 1M KCl |
|
|
Optional : 100mM MgCl2 |
|
|
Optional : 200mM EDTA |
|
|
Protein Extract |
5ug |
5ul |
Biotin-Target DNA |
20fmol |
2ul |
Total volume |
|
20ul |
#1 Biotin-EBNA control DNA
#2 Biotin-EBNA control DNA + EBNA extract
#3 Biotin-EBNA control DNA + EBNA extract + 200fold molar excess of unlabeled EBNA DNA
B. Prepare and Pre-Run Gel(6.0% non denaturing polyacrylamide gel)
• 2 ml of 5X TBE
• 4 ml of 30% Acrylamide/Bis
• 625 μL of 80% Glycerol
• 13.375 ml of deionized, sterile water
• 300 μL of 10% APS
• 20 μL TEMED
Total volume is 20 mL
100v에서 1시간 정도 pre-run - APS 제거, 전기영동 Buffer의 stabilizing factor를 분배
C. Prepare and Perform binding Reactions
Binding reaction components(EBNA control system과 sample)를 녹인 후 ice에 보관.
-EBNA extract는 사용 바로 전에 녹인다.
Section A의 table과 같이 20ul Binding reaction mixture를 만든 후 Incubation(RT, 20min)
5ul 5x loading Buffer를 각 binding reaction에 넣고 pipetting.(vortexing 금지!!)
D. Electrophorese Binding Reactions.
Polyacrylamice gel에 20ul씩 sample을 loading.
Bromophenol blue dye가 gel의 2/3 또는 3/4 이동할 때까지 100V로 전기영동.
E. Electrophoretic Transfer of Binding reaction to nylon Membrane.
0.5X TBE buffer에 10분간 membrane을 담군다.
차갑게 한 0.5X TBE buffer를 사용하고, 각 기계에 맞게 setting.
380mA에서 30~60min간 transfer한다.
Transfer가 완료되면, membrane을 filter papre에 올린 후 buffer를 뿌려주어 마르지 않게 한다.
F. Cross-link transferred DNA to Membrane
254nm 파장으로 setting 된 cross linker에 membrane을 넣고 1분간 cross link 시킨다.
G. Detect Biotin-labeled DNA by Chemiluminescence
Blocking Buffer와 4X wash buffer를 입자가 녹을 때까지 37’C-50’C water bath에서 incubation
Membrane을 20ml Blocking Buffer에 넣고 incubation(gently shaking, 15min)
Conjugate/blocking buffer를 준비
(66.7ul Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate + 20ml blocking buffer => 1:300 )
Membrane을 Conjugate/blocking buffer에 넣고 incubation(gently shaking, 15min)
1X wash buffer를 준비
(25ml 4X wash buffer + 75ml ultrapure water)
10ml 1X wash buffer로 간단하게 씻어 준 후 10ml 1X wash buffer에 넣고 incubation(gently shaking, 5min) X 4
10ml Substrate Equilibration Buffer로 membrane을 옮긴 후 incubation(gently shaking, 5min)
Substrate working solution 준비.
(5ml Luminol/Enhancer solution + 5ml Stable Peroxide Solution) * 빛을 안 받도록 주의!!!
membrane에서 Substrate Equilibration Buffer를 제거 후, working solution에 넣고 incubation(5min)
OHP film사이에 membrane을 놓고 bubble이 생기지 않게 잘 덮는다.
Chemidoc을 이용해 detection한다.
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