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trizol 로 RNA 뽑으실 때는요...
EtOH washing 과정 까지 한번하고....
dry 한후 한번더 trizol 처리해서 똑같은 과정을 반복한 것이 가장
효과적인 것 같던데요...
그리고....
DEPC-H2O 에 녹이지 마시고, formamide 에 녹이시는 것이 RNA 안정성에 효과적이더군요..
가장 현명한 방법은 TRIZOL 을 이용하여 원하는 만큼의 RNA 를
확보 하였다면 RNase free DNase 를 충분히 처리한후에 DNase 를
inactivation 하고 다음 실험을 하는 것이 좋을듯합니다.
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RNA 뽑는자
(비회원)
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03.05.10 00:00
예
그런데 그 DNase inactivation은 어떻게 시키나요
37도에서 약 5분간 처리하면 되는 건가요??
그로인해 RNA가 손상을 입지는 않나요??>?
알려주세요
꾸벅~
일단 Tissue 양을 100mg 정도로 늘려서(제가 알기로는 이게 적당량이라고 알고 있슴다.)
CHCl3 처리후 SPNTs 취하고 Trizol 1 ml 다시 첨가하여 원래의 SPNTs 보다 적게
취하시고, 다시 CHCl3 처리 하신 후 다음 과정을 진행 해 보시지요.
Trizol 처리 두 번 해 보심이 어떨까요?
그래도 결과가 안 좋을 경우
alcohol down 처리한 pellets을 RNase free DNAse I 처리 해 보는 것도 확실한 방법이
긴 하네요. 물론 깨끗하게 하려면 Protein 다시 제거해 줘야 겠지만요.
좋은 결과 있으시길..
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RNA 뽑는자
(비회원)
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03.05.10 00:00
아악! 은석씨 도대체 무슨말인지 통 모르겠어요
CHC13은 뭐고, SPNTs는 뭡니까???
DNase는 pellet을 녹인후 넣고 37도 정도에서 5분간만 처리하면 될까요?
미안하지만 자세히 말씀좀 해주세요.
저 내일 당장 실험해야 하거든요..
흑
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은석 ㅡ_ㅡ;
(비회원)
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03.05.10 00:00
CHCl3 는 chloroform 이구요.
SPNTs Supernatants(상등액) 입니다.
DNase는 37도에서 10분이면 아주 충분합니다.
저는 30분 처리한 적이 있었는 데, 새삼 놀랍더군요.
DNAse도 무서운 NZ 입니다. 쩝
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RNA 뽑는자
(비회원)
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03.05.10 00:00
아항 이제 알겠네요!
NZ라 함은 Enzyme을 말씀하시는 거지요?
자 그럼 또 질문 나갑니다.
DNase inactivation은 어떻게 하나요?
62도에서 10분간 처리하면 됩니까?
아니면 buffer가 따로 있나요?
말씀해주셔요..
답변 늦어서 죄송합니다.
DNase inactivation은 55도 10분이면 충분하구요.
물론 그냥 전기영동해도 pattern에 변화가 없긴 한데요..
inactivation후에 phenol down을 한 번 더 하셔서 ...
protein 제거 step을 진행하시면..
더 purity 높은 RNA가 뽑힐 겁니다.
buffer가 따로 있는 지는 모르겠네요...