실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
RT-PCR negative control 관련하여 질문 드립니다.
대학원생 (비회원)
RT-PCR을 진행할때는 negative control을 반드시 포함하여 진행하여야 한다고 해서
reverse transcriptation 단계에서, cDNA synthesis mix를 중에서
1. RNA templete 만 넣지 않은 것.
2. oligo (dT)20만 넣지 않은것. (final concentraion : 0.5pmol/μL)
3. reverse transcripatase만 넣지 않은것.
이렇게 3종류의 negative control을 준비하여 RT-PCR을 진행하였습니다.
그런데 밴드가 위의 3가지 negative control은 모두 나타나지 않아야 정상인데
oligo (dT)20만 넣지 않은 negative control에서 control과 같은 밴드가 나타납니다.
control은 원하는 위치에서 밴드가 나타나고, 3가지 negative control은 모두 밴드가 나타나지 않아야하는데 3가지 negative control중 oligo (dT)20만 넣지 않은 negative control만 밴드가 control과 같이 나타나고 있습니다.
RNA templete양이 많은경우 non-spectific band가 나타날 확률이 높다고 하여
RNA templete의 양을 변화시켜 보았습니다. 그런데도 마찬가지의 결과가 나타납니다.
제가 확인하려고 하는 PCR product size는 102bp이고 β-actin 입니다.
PCR은 40cycle로
Denature 94 C° 15sec
Anneal 55C° 30sec
Extend 72C° 1min
로 진행하였습니다.
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