실험 Q&A Mol. Biol.-RNA > Purification/Isolation
Trizol을 이용하여 bacteria cell (gram nega)에서 RNA isolation 질문이요!!
레벨1 김구연
Trizol을 이용한 method로 RNA를 뽑으려하는데 isopropanol 침전 후 원심분리하면 pellet이 보이지 않습니다ㅜ
대상 bacteria는 Salmonella입니다.
다음은 제가 사용한 method와 material입니다.
- Materials
1. Trizol (Invitrogen)
2. BCP (Sigma)
3. 2-propanol (덕산)
4. 75% EtOH (RNase-free water + molecular grade EtOH mix)
시약은 모두 auto는 하지않고 disposable tube에 담아서 냉장보관하였습니다.
(혹시나 이것이 문제인가하고 적어봤습니다;;)
- Methods
1. O/N culture를 1/100으로 10mL의 nutrient broth (Mueller Hinton Broth)에 접종하여 37도, 230rpm으로 O/N.
2. Culture 1mL을 9,000 rpm(12,000 g), 4도, 10분간 centri 후 trizol 1mL에 suspending하여 22.5도에서 5분 incubation.
3. BCP 200uL 첨가하여 15초간 강하게 hand-shaking 후, 22.5도에서 3분 incubation.
4. 12000g, 4도, 15분간 centri 후 500~600uL의 상층액을 새 tube로 옮김.
5. 500uL의 2-propanol 첨가 후 tube를 inverting하여 mix, 22.5도, 10분 or 상온, 1시간 침전.
6. 12000g, 4도, 10분간 centri 후 pellet을 관찰하려는데!!
pellet이 눈꼽만큼도 보이지 않습니다ㅜ
어떤 Q&A에서 순도가 아주 높을 때 그렇다고는 하던데요;;;
처음해보는 거라 다음 단계로 마냥 넘어가기가 좀 그렇네요;;;
어떤과정이 잘 못 된 것일까요ㅡㅡ
고수님들 제발 좀 가르쳐주세요~
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