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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문 단백질 정제 고수님~!!
정제~  | 2010.03.22 10:35
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
안녕하세요~

제가 특정 단백질에 대해 연구해보려고 실험을 디자인중입니다.

하지만 이 protein이 아직은 연구가 많이 되어 있지 않아 시중에서는 판매가 되지 않고 있습니다.

human과 mouse recombinant protein을 얻어 cell work과 invivo work을 하려 생각하고 있는데
제가 단백질 정제를 해본 경험이 없네요

잠깐 구글링을 해보았는데
invivo에 사용하려는 recombinant protein의 경우는 순도 99%이상이어야 한다고 나와있네요

이렇게 99%이상의 순도로 invivo에 사용할수 있는 단백질을 정제하려면 어떠한 방법을 사용해야 하나요??

GST tag을 이용한 방법이 많이 사용되는것 같은데 GST pushion에 의해서도 99%이상의 순도로 단백질 정제가 가능한가요??

간단반 방법이라던가 아니면 논문
혹은 제가 찾아볼수 있는 키워드라도 알려주시면 감사하겠습니다.
#단백질 정제
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
올챙이%자 가는거야%  |  2010.03.22   

one step 만으로 99% 순도 정제는 안될겁니다.
cell, invivo 실험에서 순도도 중요하지만 endotoxin은 문제가 안되는지 알아 보셔야 할겁니다.

taq은 어떠한것을 사용하시든 비슷하지 싶네요. cloning 을 하실거라면 하시기 편한걸로 진행하시면 될거같네요.

GST, His tag 등 종류가 많으니까요.
단백질 정제의 기본 지식이 없으신듯 한데 먼저 간단히 정제 공정 및 resin, 단백질 PI, 등에 대해서 공부를 하시고 진행하시는게 시간 낭비 않하시는 길일겁니다.

간단히 몇가지만 말씀드리면
1. cloning desin - 단백질을 soluble or insoluble로 만들것인지
                          아니면 Inclusion body 형태로 만들어 진행할것인
                          taging은 무엇으로 하며 그에따른 vector, Host 결정
2. 배양 조건 확립 - 단백질이 잘 발현되는 배양 온도, 시간 등의 확인 실험
3. cell lysis 조건 확립 - lysis 조건에 따라 이후 정제 공정에 영향을 줄수 있음.
4. 정제 전의 전처리 - Ammonium sulfate 처리, pH 처리 등등 여러 방법으로 초기 순도 향상 및 이물질 제거
-- 단백질의 PI를 안다면 pH ppt 방법도 괜찮습니다.
5. 정제 -  tag을 하셔도 순도를 더 향상시키기 위해서는 다른 추가적인 방법들이 필요할겁니다. anion, cation, HIC, Heparin resin 등등 여러 방법이 있으니 잘 디자인하시고 방법을 모색하셔야 할겁니다.

관련 단백질의 자료를 paper와 patent에서 많이 찾아보세요.

도움이 되실지 모르겠네요.

성공하세요.

꽃개구리TX  |  2010.03.24   

가장 일반적인 방법을 설명드리자면...
GST-fusion인 경우, 99% 이상 순도를 얻으려면, 3단계 정제 단계를 씁니다..

1. GST affinity column
    option : GST cleavage 단계
2. ion exchange column 
3. gel filtration column

물론 자세한 실험방법은 여기서 설명하기 힘들고, 또 논문을 찾아봐도 자세한 실험방법을 찾을수 없을 겁니다..-.-;.
단백질 정제 처음 하시는 분이 높은 순도의 단백질 정제하기도 힘들구요..
왜냐면 순도 높은 단백질 정제에는 여러가지 노하우가 필요하고, 또 FPLC같은 장치도 필요하기 때문이죠. 이런것을 다 갖춘 실험실과 co-work하시는 방법도 있습니다...

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