일단 이 vector에는 ribosome binding site가 없어서, 따로 넣어주어야 하는 상황입니다.
처음에 했던 방법은 AGGA 넣고 7base정도 any sequence를 넣어준 후에 (A와 T가 많은) ATG로 시작하게끔 forword primer를 제작하여서 cloning을 했더니, arabinose로 induction후 (0.2%, 4시간 )western결과 아주 코딱지만큼 발현하는것으로 보여서,(어느때는 아예 발현 안하는) 재 cloning을 하였습니다.
다시 진행한 방법은 제가 사용하고자 하는 protein의 앞부분을 그대로 PCR로 따와서 고유의 RBS라고 생각되는 부위까지 포함되도록 cloning을 마쳤는데. 이번엔 아예 발현도 안하네요.. arabinose로 induction이 안됩니다.
pBAD 33 vector가 cloning이 이미 되어있는것을 얻어왔기 때문에, induction의 문제인지 살펴보고자 control로 이미 cloning되어있는것 자체를 induction하였는데, coomassie blue staining으로 보일정도로 induction이 잘되는것 같습니다..