1)처음에 균주를 구매한 다음에 한번에 모두 배양하지 않고 여러 번 나눠서 키울 수가 있는지: 동결건조로 해서 어딘가에 묻혀져서 왔을 텐데 거기서 보내준 activation 어떻게 시키는지 알려주는 insert가 있을 겁니다. 그거 그대로 하시면 되는데 종이 같은 것에 동결건조면 broth에 키워야 합니다.
2) 구입후 세번정도 계대배양을 해야 튼튼한 균주를 얻을 수가 있다고 하는 데 액체배지에서 키우고 여기서 일정량을 취해 speading한다음 콜로니가 생기면 다시 액체배지에 키우는 식으로 진행하면 되는 것인지: 계대배양 방법은 선생님 마음입니다. 저는 때로는 액체액체 activation하기도 하고 때로는 그냥 agar plate에 activation하기도 합니다. 그리고 agar plate에 하는 것이 나중에 stock vial 만들 때 편하더라구요. Stock vial 만들 때는 15% glycerol + TSB에 colony를 진하게 풀어서 이를 vial에 분주하여 -80도에 얼립니다.
3) UV spectrophotometer가 없어서 생균수측정법으로 균수를 카운팅하고자 하는 데 이것은 처음에 균수를 알고 넣는 게 아니라 일정량을 스프레딩한 다음에 생긴 콜로니수를 세는 것으로 알고 있는 데 처음부터 균수를 알고 시작할 방법은 없는지: 저는 이건 잘 모르겠네요. 제가 알기론 없지만 (spectro 있으면 짐작은 가능. 그러나 이것도 총균수이고 생균수가 얼마인지는 모름) 제가 모른다고 없다고 하면 안되니까요. 다른 분께서 대답해주시길...
4) 균주를 구매하자마자 액체배지에 키운 다음에 일부는 스프레딩하고 나머지는 pellet상태로 만들어서 10~20% glycerol을 넣고 -20~-70도씨에서 보관했다가 다시 사용할 때는 한꺼번 모두 다 써야하는 지: 굳이 pellet 상태로 만들어야 하는지는 모르겠습니다. 저희 랩에서 stock vial 만드는 방법은 2번에 써 놓았습니다. 아, 다시 사용할 때는 한꺼번에 다 쓰는 게 아니구요 loop로 얼린 거 윗부분을 살살 긁어서 그걸 사용합니다. 까다로운 균 아니면 왠만하면 다 자랍니다. 그리고 stock vial은 여러번 녹였다 얼렸다 하면 좋지 않다고 하네요. 그래서 살얼음일 때 얼른 사용하고 다시 freezer에 넣습니다.
5) 균주도 변이가 생길 수 있어서 계대배양을 무한정 할 수 없다고 아는 데 몇번까지 무관한지: 글쎄요... 몇번까지 가능하다고 할 수 있을지... 이론 상으론 한번만 계대배양해도 변이가 생길 수는 있다고 하는데요. 저희 랩에서는 activation한 걸 일주일 사용하고 새로 activation하는 식으로 사용하고 있습니다.
6) 다음 세대로 넘어가기 위해 계대배양하기에 적당한 기간은: stationary phase까지 키우실 거면 overnight 하셔도 괜찮고 exponential phase까지 하실 거라면... mid-exponential 정도로 키우실 거면 3~4시간도 충분합니다.
7) 대장균을 키우기 시작해서 성장곡선상의 각각의 단계별 시간을 알 수 있는 방법은: 저희 랩에서는 spectrophotometer를 이용하고 있어요. 처음에 균을 LB broth에 overnight으로 키워서 아침에 LB broth 30 ml에 OD600= 0.1되게 맞춰서 30분 내지 1시간 마다 흡광도를 측정하는 방식을 사용하고 있습니다. 님의 랩에 spec이 없다고 하셨는데 이거 있는 실험실은 많으니까 주변 실험실에 얘기하고 빌려쓰시면 어떨까요?
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레벨1
hj-k1973
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10.02.08 19:36
냥냥님, 성의있는 답변 감사합니다
제가 있는 곳은 기업이라서 실험장비가 완벽하게 셋팅되어 있지가 않아서요
deep freezer나 UV spectrophotometer가 구비되어 있지 않습니다
균주보관은 deep freezer나 액체질소에 하는 것이 좋다고는 하나 현재 상황에선 -20도씨 냉동실에 보관해서 사용해야 할 듯 합니다
1) 계대배양 : activation을 일주일에 한번씩 한다는 것은 계속 콜로니를 streaking해서 유지한다는 말씀인지요 (제가 예전에 대장균시험을 할 때는 스프레딩해서 플레이트를 만들어놓고 필요할 때마다 콜로니따서 액체배지에 키워서 쓰고 한달정도 텀으로 해서 계대배양을 서너번까지 하고 폐기했던 것 같네요~ 그것도 너무 오래된 지라 기억이 가물거리네요) 변이인 걸로 실험을 하면 결과를 신뢰할 수가 없어서 사실은 이부분이 가장 염려가 되거든요
세포배양같은 경우는 10번까지 계대배양하면서 계속 stock 만들어놓고 10번이 넘는 것은 모두 폐기하는 식으로 진행했었습니다 균주도 비슷한 방식으로 stock을 준비하면 될까요
2) 균주보관 : 님께서 말씀하신 대로 -20도씨에서도 동일하게 해도 몇번은 쓸 수 있을까요
최대한 적은 양을 stock으로 만들어놓고 한두번 쓰고 버리는 식으로 해야되나 싶네요
* stock용 vial은 세포배양에서 쓰는 거랑 같은 거 써야 되나요 아님 그냥 e.tube도 가능?
님께서 답변 다신 것을 이제야 봤네요. 다시 질문하신 것에 대한 답변을 올리겠습니당.
1) 계대배양 : activation을 일주일에 한번씩 한다는 것은 계속 콜로니를 streaking해서 유지한다는 말씀인지요 (제가 예전에 대장균시험을 할 때는 스프레딩해서 플레이트를 만들어놓고 필요할 때마다 콜로니따서 액체배지에 키워서 쓰고 한달정도 텀으로 해서 계대배양을 서너번까지 하고 폐기했던 것 같네요~ 그것도 너무 오래된 지라 기억이 가물거리네요) 변이인 걸로 실험을 하면 결과를 신뢰할 수가 없어서 사실은 이부분이 가장 염려가 되거든요
세포배양같은 경우는 10번까지 계대배양하면서 계속 stock 만들어놓고 10번이 넘는 것은 모두 폐기하는 식으로 진행했었습니다 균주도 비슷한 방식으로 stock을 준비하면 될까요
: 저는 activation을 한 plate에서 계속 하는 건 아니고 stock해 놓은 걸 streaking하는데요, 어차피 plate에 만들어둔걸 계속 계대배양한다면 애들의 성격이 달라져서 표준균주의 성질을 그대로 유지하고 있기 어려울 수 있다고 생각하기 때문에 그렇습니다. 님께서 사용하시는 방식처럼 plate 하나 만들어 두고 그걸 계속 계대배양해서 쓸 수도 있겠지만 한달정도 보관하신다면... 보관 과정에서 오염이 될 수도 있고... 보관을 잘했다면 가능할 수도 있지만... 걱정을 하면서까지 그걸 그냥 쓰느니 stock을 하나 더 만들고 여유로운 마음으로 쓰는 게 더 나을 것 같네요. 그리고 세포배양 같은 경우, 계대배양하면서 계속 stock 만드는 게 어떤지는 확실히 잘 모르겠습니다만, 세포는 passage가 커질 수록 differentiation이 일어날 수 있어 원래의 성질을 잃는 것도 있다고 알고 있습니다. 저는 neuronal cell 이용하고 있는데 이건 #20 넘으면 안된다고 해서 완전 신경을 쓰고 있습니다. 균주는 이렇게까지 하지는 않아도 되니 그나마 다행이라고 할수 있죠. 참, 그런데 세포와 균주를 한 실험실에서 같이 다루고 계세요? 그러면 벤치는 따로 쓰시나요? 같이 쓰신다면 UV 켜두시고 알콜 소독 철저히 하시고 가능한 세포를 먼저 다루신 후 미생물을 다루세요. 세포에 미생물이 오염되면 정말 답없고 힘들거든요.
2) 균주보관 : 님께서 말씀하신 대로 -20도씨에서도 동일하게 해도 몇번은 쓸 수 있을까요
최대한 적은 양을 stock으로 만들어놓고 한두번 쓰고 버리는 식으로 해야되나 싶네요
: -20도에 보관한 것도 1년 정도는 염려없이 사용할 수 있습니다. 다만 activation했을 때 활성정도가 좀 다를 순 있죠. 그리고 까다로운 균 같은 경우는 1년까지도 살아있지 않습니다. 대장균 같은 애들은 1년 까지는 무사해요. 저는 stock 만들 때 1ml 정도씩 분주해서 이걸 얼렸다가 윗부분을 긁어서 사용하기 때문에 몇 회까지 쓸 수 있다고 말씀드리긴 힘들지만 여튼 무지 오래 씁니다.
* stock용 vial은 세포배양에서 쓰는 거랑 같은 거 써야 되나요 아님 그냥 e.tube도 가능?
: vial은 세포배양 꺼 써도 되고 뭐 아무 cryovial이나 멸균만 되어 있으면 상관 없습니다. 실제 e-tube에 stock만드는 실험실도 봤어요. 하지만 handling이나 이런 걸 고려했을 때는 screw cap이 있는 vial에 보관하는 것이 좋다고 생각합니다.