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질문 국산 pfu taq과 takara ex taq... 으로 pcr할때,,,
pcr  | 2010.01.29 16:52
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
pcr product의 크기가 약 1.2kb가 됩니다. 정확하게 합성을 해야 했기에 pfu 계열의

taq을 사용했고 특히 blunt로 나와야 했기에 takara ex-taq은 좀 자제하고 국산 pfu

taq을 사용했습니다. 그런데 국산 pfu taq은 거의 안나오거나 나오더라도 상당히

흐리게 나오네요.. 대신 100~200bp 부근에서 band가 엄청 진하게 나옵니다.

왜 그럴까요? 혹시나 primer annealing이 좀 다를지 몰라서 takara ex taq을 사용했는데

제가 원하는 위치에서 band가 젤을 뚫고 나올정도로 터질려고 하네요..

물론 takara는 사용못하구요.. 왜냐면 blund가 아니고 a가 붙었기 때문에..쩝..

참고로 template는 plasmid를 사용했고 크기는 3kb정도 됩니다.

primer는 long primer이고 약 75mer 정도이고 plasmid와 붙는 크기는 25bp정도 됩니다.


그래서 takara ex taq으로 pcr을 수행하고 그것을 전기영동한 후에 band를 잘라내서

purification을 했고 여기서 나온 elution된 pcr product을 template로 삼아서 다시한번

같은 primer로 pfu taq을 사용해봤는데 결과도 역시나 마찬가지로 낮은 사이즈에서

강하게 밴드로를 보이네요..


제 생각에는 아무래도 primer끼리 붙는 경향이 좀 있는 것 같은데,,

taq 특성상 그러는 것인가요? 고수님들의 답변 부탁드립니다. takara는 잘되는데,,T.T


TAKARA가 너무 비싸고 재고도 국내에 잘 없어서 너무 늦게 오고,,그래서 국산 taq을

사용한것인데,,영,,,결과가 시원치 않네요..


제가 혹시 놓치는 것이라도 있는지 알려주시면 감사 또 감사하겠습니다.


연구비 압박이 있어서 좀 줄여볼려고 국산 써볼려고 했건만,, 역시 미니프렙만 국산것으로

사용해야 하는 것인가요? T.T
#PCR
 
#taq
 
#pfu
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리엘피스  |  2010.01.29   
두가지를 생각해 보시면 됩니다.
첫째, Pfu의 extension rate와 processivity는 Taq에 비해 현저히 낮습니다. 이는 proof-reading기능이 있기 때문으로 Pfu에서 3->5" exonuclease activity를 없애면 yield는 Taq과 비슷해 집니다.

이러한 Pfu의 특성으로 인해 template의 농도를 높이거나 cycle수를 많이 주어 증폭을 해야 하며, 또한 Pfu에 alpha의 물질을 첨가하여 extension rate를 높인 TurboPfuPfuUltra가 무지마지한 가격으로 판매되고 있는 것입니다.

둘째, Ex-Taq은 Taq과 proof-reading기능이 있는 Pfu를 섞어놓은 blend Taq입니다. yield나 또는 증폭 size는 만족할만 하지만 fidelity는 Pfu를 단독으로 사용했을때와 비교하여 낮습니다.

따라서 Pfu와 Ex-Taq은 yield면에서 비교의 대상이 될 수 없습니다.

Pyrococcus종에서 분리한 DNA polymerase들은 대부분 proof-reading기능이 있습니다. 이중에서 Pfu가 가장 yield가 낮은 효소중 하나이며 그외에 다양한 제품들이 있습니다. 아직 국내에서는 Pfu를 제외한 다양한 Pyrococcus 효소들이 개발되지 않은 것으로 알고 있습니다. 
초킬  |  2010.01.30    
엘비스님 말씀에 동의 합니다.

전 같은 회사에서 taq, high fidelity, pfu 를 사용하고 있는데요.
동일하게 실험 하면 pfu는 앞에 두게와는 달리 아주아주 증폭양이 적습니다. 조금더 optimize 시키시고 사용하시면 좋을듯 합니다.
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