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RAW264.7 cell 은 trypsin 처리하면 cell 모양이 변하기 때문에 계대 할때 스크래퍼로 긁어서 cell 을 모아서 계대하셔야 합니다.
media 를 3ml 정도 넣어주시고 너무 쎄게 박박 긁지 마시고 살살 긁으면 cell 이 떨어지는 것을 볼 수 있습니다.
그리고 cell 냉동이라고 하셨는데 이건 stock 을 만든다는 말씀이신가요?
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엉엉^^
(비회원)
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10.01.27 18:09
답변 감사합니다.
cell stock 하는거 맞습니다.
어떻게 하는지 알려주세요
*^^*
Raw264.7 cell stock 만드는 것은 일반 cell stock 만드는 방법과 동일 합니다.
각각 실험실마다 방법이 조금씩 차이는 있지만 저희방의 경우를 적어 드립니다.
특별한것은 없고 다만 cell 상태가 쌩쌩하고 좋을 때 만드는 것이 가장 중요하겠죠.
(1) cell stock 을 풀어서 약 70%이상 자라면 1x PBS로 5 ml/plate씩 첨가하여 두 번 정도 washing한다.
(2) DMEM을 3 ml/plate씩 넣고 스크랩퍼를 이용하여 바닥에 붙어 있는 cell을 긁은 다음, cell을 15 ml tube에 모아준다.
(3) cell을 모은 12 ml(3 ml/plate x 4plate)정도를 두 개의 15 ml tube에 6 ml씩 분주한 다음 DMEM를 각각 4 ml씩 첨가하여 혼합한다.
(4)700 rpm 에서 5분간 원심분리한다.
(5) cell pellet만 남기고 위의 상층액은 모두 흡입 제거한다.
(6) 배지를 4 ml씩 첨가하여 뭉쳐진 cell이 없도록 충분히 pipetting한 다음 두 개의 tube를
하나의 tube 에 모은다.(총8 ml)
(7) 8 ml중 1 ml은 subculture하는데 사용하고, 나머지 7 ml은 cell stock을 만드는데 사용한다.
*cell stock을 만들 경우 cell이 포함되어 있는 배지 7 ml에 DMSO가 10% 가 되도록 만든 다음 CryoTube vial에 1 ml씩 옮긴다. 스티로폼에 vial을 넣고 deep freezer에서 하루 정도 보관하고, 질소탱크로 옮겨 보관한다.