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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문 western blot 통하여 인산화 protein H2A.X 발현 평가하려는데요,,,
알brother. H  | 2010.01.19 16:35

NIH3T3 세포에 산화적인 스트레스(hydroxyl radical) 주고 24시간 배양후 NP-40으로 lysis(4시

간) 시킨후 단백질을 추출하여 15% 아클라마이드 겔에 전기영동한후 5% nonfat milk 로 1시간

30분 blocking 후에 3회 0.1% tween 20 으로 3회 워싱후 1차 antibody 1:1000(5%BSA) 처리하

고 18시간 4도에서 반응시킨후 3회 워싱하고 2차 antibody(5%non fat milk) 처리후 1시간후 워싱

한다음 사진 촬영했는데요.  아무것도 나오지 않네요, 방법은 논문보고 한것이구요.. 틀린점이
있으면 수정해주세요..  급합니다.. 또한 H2A.X 단백질 발현을 다른 방법으로 알수잇는방법도

가르쳐 주시면 감사하겟습니다. 답답해 미치겠습니다.

#인산화
 
#H2A.X
 
#western blot
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리bio  |  2010.01.19   

NP40만으로 nuclear membrane을 깨기 어려울텐데요..
phosph-H2를 확인하시려면 histone extract를 사용하시던지 nuclear fraction을 사용하셔서 확인하셔야 할것입니다.
보통 lysis buffer에 0.5-1% SDS를 넣어주면 nuclear membrane도 완전히 깨집니다..

알홍오빠  |  2010.01.20   

답변 감사합니다.

그럼 SDS가 첨가하게 되면 bradford 용액으로 단백질 정량이 안되지않나요?

그리고 첨가하려면 NP-40 에 첨가하라는 말씀인 가요?>

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