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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 [급] PCR 질문입니다.
PCR 초보  |  2006.01.16 00:00
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
PCR product를 gel extraction 하기 전 전기영동시켰을 때,
원하는 size는 나오지 않고 오히려 그보다 훨씬 더 큰 size의 밴드만 보이네요.

PCR뜬 것은 rat의 STAT6이고, size는 359bp (northern probe용),
primer는 upper 21mer, lower 19mer짜리를 사용했습니다.

처음에는 primer 부분 외에는 band가 보이지 않아서 annealing temp.를 계속 낮추어보았습니다. 대략 50도까지...

그러다 annealing temp를 50도로 설정하여 PCR을 수행한 결과 750bp 정도에서 band가 보이는데 그 이유를 도무지 알 수 없네요.

이럴 경우 어떤 원인이 있을 수 있으며, 해결 방법에는 어떤 것이 있을 수 있는지 조언 부탁드립니다.
#PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
chemii  |  2006.01.16    
먼저 primer의 Tm값이 비슷한지 보시기 바랍니다.
Tm값이 차이가 많이 나면 Tm이 높은 primer로만 증폭되는 경우도 있습니다.

또한 plasmid를 가지고 probe를 만드시는 거라면 template로 사용한 plasmid의 양을 확인해보시기 바랍니다. 10ng정도로 사용하시는게 적절합니다.

tag을 바꿔보시는 것도 좋습니다. premix같은 tag보다는 Extag같은 것들이 잘 잡힙니다.

이렇게 해도 안되시면 primer를 다시 design해보세요.
primer의 길이가 길어지면 non specific band가 적게 뜨는 경향이 있습니다.
그리고 반드시 hair pin 구조가 있는지 또다른 구조를 형성하는지 primer design하는 프로그램을 사용해서 확인해보시기 바랍니다/

도움이 되셨으면 합니다.
병리초보  |  2006.01.16    
비특이적 증폭이 된 경우겠죠.

원하는 사이즈보다 큰 밴드가 뜰 경우는 elongation time를 줄여서 큰 사이즈의 증폭을 억제하는 방법을 사용하시면 해결이 가능할 것입니다.

물론, 이렇게 한다고해서 원하는 밴드가 나온다는 보장은 없습니다.^^

그건 조건을 따로 잡으셔야 하죠.
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