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레벨5
propadrum
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09.12.25 03:10
어느 정도의 논문에 내시는가에 따라서 조금은 다를 수 있겠지만요..
일단, Tag을 바꿔서라도 reciprocal IP는 왠만하면 하는 게 좋을 것 같네요.
그리고, 요샌 endogenous interaction도 왠만하면 요구하는 추세인것 같구요..
(특별히 기술적인 문제가 있는게 아니면.. endo잡는 제대로된 antibody가 없다던지..)
His-pull down을 하셧지만,, pure한 protein의 interaction을 본 건 아니어서,,
direct interaction이라고 보긴 어려울 것 같아요.
가능하면 E.coli에서 purify하시던가, in vitro transcription/translation을 하셔서,,
in vitro binding을 보시는 게 좋을 것 같네요..
(이것도 불가능 하시면.. overexpression system에서 몇개의 deletion이나 point mutation만으로
binding이 안되는 mutant를 보여주면서,, interaction이 specific하다고 할 순 있지만..
reviewer 입장에서 좋게 보진 않겠죠..)
아니면,, protein-protein interaction에 modification이 꼭 필수적인건지요?
근데,, interaction실험만 언제까지 할 수 있는 건 아니니까요,,
논문을 위해서 최대한 완벽하게 노력하시면서,
다른 fuctional study도 병행하시는게 젤 좋을 것 같아요^^
아무래도,, 이정도 binding data있으면 되겠지.. 하고 논문 내면,,
reviewer들이 다 보여달라고 하는 경우가 많긴할꺼에요..
긍정적으로 '보여줘라'라고만 얘기하면 하면 되는거지만,,
그런 부족한 부분들이 쌓여서 부정적인 이미지를 갖게 하는 것 좋지않으니까요^^
그럼,, 한 해 마무리 잘 하시구요~
좋은 결과 있으시길~ ^^
purified protein을 binding하는 것을 보여주는 것은 direct binding을 증명하기 위함입니다,
님께서는 이미 Y2H를 하셨기 때문에 direct binding을 보셨다고 생각됩니다.
오로지 binding으로만 논문을 내실 것이 아니시라면,
immunocytochemistry 로 merge하는 것 보이기, 두 단백질의 expression profie 보이기(정말 두 단백질이 동시에 발현되어 작용하는 조직이 있는가), 공히 발현하는 조직에서 immunohistochemistry하여 merge보이기
정도로 실제로 일어나는 현상임을 보이시고 나서,
funtional study를 통해 binding이 가지는 의미 찾는 것이 더 나아 보입니다.
혹, 둘 중 하나씩 KD나 KO시킬수 있는 여력이 있으시면 해 보는 것도 좋아 보입니다.
우선 연말에 바쁘실텐데 답변주신 분들 너무나 감사드립니다.
한해 마무리 잘 하시고 복 많이 받으세요~
현재 binding 실험진행하고 있는 protein 두가지 모두 기능이 거의 밝혀지지 않은 protein이라 antibody 자체를 구하기도, 또한 commercial Ab를 구했지만 WB만 가능한 상태입니다. 그래서 tag을 이용하여 IP를 한 것이고요.
아무래도 답변에 주신 의견처럼, binding 이후의 의미에 대해 (이 역시 쉽진 않은 상태지만) 심도깊게 진행해야 겠네요..
하나더 질문 추가 한다면..
님들께서는 Y2H에서 나온 candidate proteins이 약간씩 다른 x-gal activity를 보이는 것이 여러개일때 어떻게 의미부여를 하시는지요?