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Pull-down의 객체가 GST-A인가요 아니면 endogenous A인가요?
보고자 하는 것이 A인가요 아니면 A와 결합할 것으로 생각되는 다른 것들인가요?
GST-A gene을 cell에 넣고 하는 실험인가요? 아니면 extract에 정제된 GST-A를 넣은 후 pull-down을 하려는 것인가요?
질문하신 내용의 문맥상 pull-down은 GST-A를 이용하는 것이라 생각됩니다만. 그렇다고 한다면 GST-A에 붙은 extract중의 단백질 분석이 목적이 될 것이라 보여지는데, 이경우에는 endogenous A의 존재가 방해가 될뿐입니다. 물론 실험의 진행상 과정과 목적에 따라 time-course는 달라져야 하는 내용이긴 하지만.....
답변 감사드립니다.
GST-A를 E.coli로 부터 유도하여 정제후 Raw264.7 cell lysate에 넣어서 pull down assay를 하여 A라는 단백질과 상호작용하는 다른 단백질을 screening해볼 예정입니다.
A가 Raw264.7 cell에서 유도되는 시점(LPS처리후 12시간째)의 lysate라면
endogenous A에 방해를 받긴 하겠지만..
그 A와 상호작용하는 단백질을 찾고자 하는 목적이면.. LPS처리후 12시간째의 lysate로 pull down assay를 해야 할 것 같아서요..
A가 없는..시간대의 lysate.. 사용한 결과로 A와 상호작용하는 단백질이라고 얘기하기가 어렵지 않은지요..