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Cell signal 사 제품이라 할지라도 일반 blocking buffer에 항체를 희석해도 큰 문제가 발생하지 않습니다.
하지만 (매두 드물지만) 결과가 잘 나오지 않아서 업체에 이의를 제기하는 경우 BSA에 항체를 희석하여 다시 시험해보라고 합니다.
제 경험을 말씀드리면cellsignal 사의 항체를 탈지유에 희석해 사용해서 결과가 나오지 않아서 BSA을 사용했지만 역시 결과는 나오지 않은 적이 있습니다.
Blocking solution의 %는 사용자의 임의로 조절 가능한 것입니다. Milk라고 해서 꼭 5%를 써야 한다라는 룰은 없으며, signal to noise에 따라 1%에서부터 5%까지 자유롭게 사용이 가능합니다.
Blocking %가 높아지면 background는 그만큼 적어지지만 affinity가 낮은 항체의 경우 signal도 줄게 됩니다. 따라서 여러 %의 milk를 테스트해보는 것이 가장 좋습니다.
저같은 경우엔 1% milk를 주로 사용합니다. 이는 저희 연구실에 가지고 있는 milk가 3%이상에서는 signal이 전혀 나오지 않기 때문으로, 이같은 맥락에서 봤을때 milk의 제품특성에 따라서도 결과가 많이 차이나는 것을 볼 수 있습니다. 심지어는 milk제품 두 bottle이 있는데 이 둘의 특성마저도 많이 다름니다.
결론적으로 signal을 잘 잡을 수 있도록 현재 조건에서 여러가지를 바꿔가며 최적화하는 작업이 한번은 필요합니다.
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레벨5
propadrum
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09.12.03 02:55
혹시 샘플은 어떤것을 사용하셨나요?
p65와 IkBa는 basal level이 높아서 왠만하면 잘 될텐데요,,
IkBa는 santacruz (sc-371)꺼도 굉장히 잘 잡히는데,,
phospho-IkBa는 normal condition에는 굉장히 약할 수도 있어요.
TNF나 LPS정도 처리하시고 보시는게 좋을 듯 한데요..
(TNF라면 5-15분 정도에서 가장 강할거에요. 금방 degradation되어서 없어지거든요;;)
저도 cell signaling 꺼 썼구요 (#9246)
1:1000 5% BSA에 했구요,,
혹시 secondary antibody 비율을 최대한 높여보세요.
ECL을 강한걸 쓰시거나;;
primary는 일단 O/N하시는게 더 강할 것 같구요,