저는 한스님이 아닙니다만, PCR 기계가 문제를 일으켜서 손보셨다면, 다른 기계를 한번 써보십시요. Thermal cycler가 그냥 온도만 오르고 내리는 단순한 기계같지만, 그 콘트롤의 정밀도와 방식에 따라서 PCR에 상당히 많은 영향을 줍니다. 그리고, 효소반응의 경우는 넘치고도 남는 정도의 처리조건으로 보입니다. 하나만 더 말씀드리면 20uL씩 3-4판씩 PCR을 하실거면 차라리 그냥 50uL reaction을 한번만 하는 쪽을 한번 생각해보십시요.

그리고 전에 젤 사진도 올리셨었는지 궁금한데, 제한효소를 처리하지 않은 PCR 산물의 경우는 1.3kb 밴드만 깨끗하게 나오고 있지요?

잘은 모르겠습니다만 RFLP를 보신다면 PvuII digestion에서
1) 1.3kB가 나오는 경우는 PvuII 에 의해서 cleavage가 일어나지 않는 경우일테고 (첨부하신 논문에 따르면 PP 이겠지요.)
2) 1.3kb, 850bp, 450bp가 나온다면 (partial digestion이 아니라는 가정하에) 한쪽 allele만 cleavage site가 있을거라고 볼 수 있으므로 Pp 일테고
3) 850bp, 450bp가 나온다면 두 allele이 다 cleavage site가 있는것이니 pp가 되겠군요.
4)의 경우는 말씀처럼 작은 size가 잘 안보이는 경우일 수 있을것 같네요.

PCR이 잘 안되는 점은 condition을 잡아 개선이 될 경우 더 쉽게 실험이 진행되실 것 같습니다만 product가 그렇게 나오는 것은 polymorphism을 잘 보여주는 결과 아니겠습니까?

이 위에도 질문을 올리셨네요.. 괜히 저 밑에가서 답변을 올렸나보네요.
Juno님 말씀대로 RFLP에의한 genotype 결정시
2가지 효소 처리시 총 8가지 경우의 genotype이 생깁니다.

Pvu2 / Xba1 모두 안잘림 --> 2개의 효소처리해도 각각 1.3kb 밴드보임--> PPXX
Pvu2 / Xba1 둘다 잘림 --> 각 효소처리시 0.85/0.45 와 0.9/0.4 보임 --> ppxx
Pvu2만 잘림 --> Xba처리시 1.3보이고 Pvu처리시 0.85/0.45보임 --> ppXX
Xba1만 잘림 --> Xba처리시 0.9/0.4보이고 Pvu처리시 1.35보임 --> PPxx

hetero allele일 경우
Pvu2처리 1.3 / 0.85 / 0.45 보이는 경우 Pp type
Xba1처리 1.3 / 0.9 / 0.4 보이는 경우 Xx type

밴드 사이즈는 SB를 이용한 전기영동(1.5% agarose gel)에서 확실하게 구분될 수 있는 밴드크기입니다. 별 어려움없이 구분가능하다는 얘기이죠.

아래에서도 말씀드렸듯이 PCR 조건을 잘 맞추셔야 많은 양의 amplicon을 얻을 수 있으며 그래야 밴드도 정확히 보입니다. 그래도 PCR이 잘 안된다면 그냥 EtOH 침전으로 농축하는 방법이 있지만, 아무리 그래도 추천하는 방법은 PCR 조건을 다시 잡는 것밖에 없습니다.

답변 주신 크림슨, juno, 한스님~~ 정말 감사드립니다. T.T
이렇게 멀리서나마 도와주시는 분들이 계시다고 생각하니 힘이 납니다. ^^

근데... 제 실험에서는 restriction enzyme인 PvuII와 XbaI을 각각 처리하고 있습니다.
Double digestion이 아닌.... 같은 sample을 2개 가지고... 각각의 enzyme으로 처리 중인데요.... 이럴 경우는 juno님이 말씀하신 cleavage가 일어나지 않은 경우, PP, Pp, pp의 네 가지 경우가 나타나게 된다는 말씀이시지요...??

PCR 조건이 꽤 오랜 시간 동안 해 왔음에도... 또렷한 band를 얻을 수 없었지만(약간 끌리거나 band가 또~렷하지 않습니다)....
band가 나오기에 급한 마음에 그 products를 가지고 실험을 시작했습니다.
여러 도움 주신 분들의 말씀을 종합해 보면...
우선 PCR 조건을 다시 잡고 난 후.. 제가 해 오던 방법대로 enzyme을 처리하면 결과를 얻을 수 있다는 말씀 맞는지요... ^^;;;

그동안
1) Premix(저희 실헌 여건상 premix를 사용할 수 밖에 없거든요..)제조사별로,
2) Gradient
3) PCR machine의 온도 control 방식(Block방식, caculate방식)
4) Template DNA와 primer농도 조절
5) GC contents가 높을 수도 있다기에 (human DNA의 경우 높다고 하더군요)
GC contents를 낮추는 시약 첨가...

을 바꾸어 가며 모든 실험을 해 보았습니다.
에고~~이젠 어떤 방법을 사용해야 또렷한 PCR band를 얻을 수 있을지 모르겠습니다 T.T
또 확인해 보아야 할 방법이 무엇이 있을까요..??

계속 답글을 이어서 남길 경우 제일 처음 원글만 보이기 때문에 바로 이전 질문내용이 안보여서 참 불편하네요. 이건 게시판 관리자님께 건의를 해야겠네요.
말씀하신대로 homo일 경우에는 혼합된 pattern이 보이지 않지만 allelomorphic character를 가진경우에는 혼합된 pattern이 보이게 됩니다. 우선 RFLP를 보시기 전에 충분한 PCR 산물을 얻은 후에 RFLP를 해보십시오.
제가 볼 땐 DNA의 purity가 떨어지거나 DNA양을 너무 많이 사용해서 PCR이 잘 안되는 것 같습니다. DNA를 어떻게 준비하셨는지 모르겠지만 (그리고 DNA양이 얼마나 있는지도 모르겠지만) template DNA를 1/10 희석해서 PCR을 해보세요.
그리고 이메일 연락이 더 쉬울 것 같네요. aod님의 연락처를 남기시면 연락드리죠.

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