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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR 결과 두리뭉실한 밴드의 정체는?
PCR초보  |  2006.02.02 00:00
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: actin_1.jpg (111 KB)
이미지 첨부파일
안녕하세요-
항상 이 게시판에서 많은 도움을 얻고 있습니다.
PCR을 처음 하고 있는데, 도통 알 수 없는 결과들이...

첨부한 사진 중 레인이 많은 것을 1번, 적은 것을 2번이라고 하겠습니다.

rat brain의 total RNA 를 뽑아서 RT를 한 후, actin primer를 사용해서 pcr 을 돌렸습니다. (30cycle)

그 결과가 2번입니다. 상식적으로 모든 레인에 왕창 나와야 하는데 왜이리 조금 나왔을까요-

그런데 보통 RT 이후에 dilution 을 하지 않습니까- dilution을 깜박 잊었던 것입니다.
그래서 DEPC water로 dilution 하고, 다시 PCR 을 돌려서 gel 에 달려 보았습니다.

그 결과가 1번입니다. 2번은 왜 1번과 모양 차이가 이리 많을까요.
actin band가 두리뭉실하고, 작은 사이즈의 엄청 많은 두리뭉실한 것들은 1번에선 없었는데 도대체 무엇이며, 왜 생긴 것일까요?

실험 과정 중 어느 부분을 점검해야 할 지 느낌이 오시는 분들께서 좀 도와주시면 정말정말 감사하겠습니다...

ps. 또 2번에서 actin 이 많이 나와야 할 것 같은데 조금 나오는 것도 이상합니다. PCR을 30cycle 돌렸으면, cDNA가 조금만 있어도 엄청 많은 DNA가 만들어져야할텐데..

#PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
PCR초보  |  2006.02.02    
첨부파일 파일첨부: actin_2.jpg (102 KB)
이미지 첨부파일
첨부파일
(주)파마테크  |  2006.02.02    
전기 영동 1번 2번 사진을 볼때 전반적으로 band가 sharp하지 않고 smear하게 끌리는 부분이 많습니다. 이런 경우 template degradation 또는 template 상태가 좋지 않은 경우가 많습니다.
사진 1번의 경우 cDNA를 depc water에 dilution해서 사용했다면 reaction이 depc에 영향을 받을 수 있습니다. 보통 RT PCR후 cDNA가 합성되면 DNA가 stable해지기 때문에 DEPC water를 사용 안해도 됩니다.
그리고 2번 사진을 보면 PCR 증폭 효율이 아주 낮습니다.
그래서 전반적으로 볼때 실험적인 skill이나 조건의 문제라기 보다 template문제라고 판단되어집니다. 즉 rat brain에서 mRNA를 뽑을때 부터 다시 check해 보세요.

mRNA가 degradation되지 않았는지?
cDNA가 제대로 합성되었는지?
합성된 cDNA 양은 얼마인지? cDNA량이 적으면 dilution할 필요가 없겠죠..template 량이 작으면 primer competition이 일어나서 원하지 않은 부위에 band가 detection되는 경우도 있습니다. 그래서 template양도 중요하지요.

실험에 도움이 되었으면 하네요...^^
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