5~6m 전개속도가 5분이라고 쓰셨는데 5~6cm인가요?
아미노산은 닌하이드린을 사용하면 확인 가능합니다.
spot만 찍어서 말린 후 황산으로 태워보세요..
그래도 흔적이 안나오면 발색시약 바꿔보세요..
아미노산이 포함되어 있으면 UV(간편하게는 clean bench UV사용 가능) 밑에서 보면
적,보라 색으로 보입니다.
spot 말린 후 silica plate를 UV밑에서도 확인해 보세요..
5~6cm입니다.^^;
전개시켰던 판을 UV에 비춰 봤는데 확인하기가 힘드네요.
1. 황산으로 태워 보라고 하셨는데 100%황산에다가 넣었다 빼란 말씀인가요? 자세한 설명 부탁드립니다. 참 이 경우 궁금한 건 실리카겔이 OH group을 가지고 있어서 산에 깨져 버린다고 하는데 괜찮은지 궁금합니다. 그리고 실험을 해보다가 본건데요 극성고정상이여서 15% 용액에도 뿌려줄때 분무가 많이 되면 상이 흐물흐물해져 버리는데요 이 때 상에 붙어있는 시료가 발색시약에 녹아나올 수도 있는지 궁금합니다.
2. 닌히드린 반응에 이용하는 적당한 농도와 방법의 자세한 설명을 부탁드립니다.
그리고 이건 질문인데요 반응전 물질을 대조군으로 비교할때 aa는 닌히드린으로 알 수 있다고 하고 반응물도 ring 에 결합된 aa에 의해서 거리를 알 수 있게 되지만 ring 자체를 검출 할 수는 없을 것 같은데 스피드님의 생각은 어떤가요?
Q. 전개시켰던 판을 UV에 비춰 봤는데 확인하기가 힘드네요.
= 전개 시킨 후 황산 발색을 했다면 UV밑에서 안보입니다.
시료 spotting 후 전개 -> dry -> UV순으로 해서 안보이면 시료 농도 문제를 일단
검토해 보세요..
Q. 황산으로 태워 보라고 하셨는데 100%황산에다가 넣었다 빼란 말씀인가요?
100% 황산은 아니구요 현재 사용하고 있는 발색 시약 조성의 황산 용액입니다.
Q. 참 이 경우 궁금한 건 실리카겔이 OH group을 가지고 있어서 산에 깨져 버린다고 하는데
괜찮은지 궁금합니다.
= 그런 경우는 경험해 보지 못했고 어떤 발색시약을 사용해도 문제점 없었습니다.
Q. 그리고 실험을 해보다가 본건데요 극성고정상이여서 15% 용액에도 뿌려줄때 분무가
많이 되면 상이 흐물흐물해져 버리는데요 이 때 상에 붙어있는 시료가 발색시약에 녹아나올
수도 있는지 궁금합니다.
= 분무가 많이 되면 상이 흐물해진다고 하는데 어떤 상황인지 이해가 잘안됩니다.
전개 후 완전 dry -> 발색시약 분무 -> 고온 반응 하시면 되고 완전 발색시약이 흘러내릴
정도로 분무하지 안아도 됩니다.
Q. 닌히드린 반응에 이용하는 적당한 농도와 방법의 자세한 설명을 부탁드립니다.
= 약간씩 틀린 종서잉 여러개 있는데 그중 한가지를 알려드리죠
Ninhydrin Solution
100 ml container
0.2 g Ninhydrin
0.5 ml Acetic acid
100 ml n-Butanol
4.5 ml Water
Q. 그리고 이건 질문인데요 반응전 물질을 대조군으로 비교할때 aa는 닌히드린으로 알 수
있다고 하고 반응물도 ring 에 결합된 aa에 의해서 거리를 알 수 있게 되지만 ring 자체를
검출 할 수는 없을 것 같은데 스피드님의 생각은 어떤가요?
= ring 검출 한다기 보다 반응전 물질을 control로 해서 반응 후 물질의 Rf값이 틀려지기
때문에 구별이 가능합니다.
TLC에서 반응 후 물질을 분취하여 알고 있는 반응 후 물질 과 LC에서 RT값을 비교하여
증명하면 됩니다.
스피드님 자세한 답변 감사드립니다. ^^
답면을 보면서 궁금한게 있어서 다시 질문을 드리는데요
1. 100% 황산은 아니구요 현재 사용하고 있는 발색 시약 조성의 황산 용액입니다.
=> 전 황산15ml/ H2O 100ml로 만들었는데 이렇게 단순히 황산만 넣으면 되는 건가요? 몇개의 정보를 찾아봤을 때 딱히 만드는 법이 언급된 부분이 없어서 15% 용액을 제조했는데 맞게 만든건가요?
2. 그리고 실험을 해보다가 본건데요 극성고정상이여서 15% 용액에도 뿌려줄때 분무가
많이 되면 상이 흐물흐물해져 버리는데요 이 때 상에 붙어있는 시료가 발색시약에 녹아나올
수도 있는지 궁금합니다.
=> 15% 용액을 뿌려주거나 또는 담궜다가 뺏고 손이나 핀셋으로 누르면 실리카겔이 떨어져 나오거나 표면에 맴돌고 있는 여분의 발색시약 때문에 표면이 밀린듯이 균일하지 않게 보여서 그렇습니다. 이 때 실리카겔에 있는 분석 물질이 녹아나오지 않나 걱정이 되서 질문을 하게 되었습니다.
1. 전 황산15ml/ H2O 100ml로 만들었는데 이렇게 단순히 황산만 넣으면 되는 건가요?
= TLC 발색에서 사용하는 황산 용액은 10~20%사이 입니다.
보통은 다른 물질과 혼합해서 사용하는 경우가 많습니다.
제가 답변한 내용 중에 실제 님이 예비 테스트를 해보면 알수 있다고 적어놨습니다.
TLC plate에 시료를 농도 별로 몇개 spotting해서 전개를 하지말고 건조 후 황산 발색을
해보면 현재 발색시약이 사용가능한지 알수 있습니다.
2. 그리고 실험을 해보다가 본건데요 극성고정상이여서 15% 용액에도 뿌려줄때 분무가
많이 되면 상이 흐물흐물해져 버리는데요 이 때 상에 붙어있는 시료가 발색시약에 녹아나올
수도 있는지 궁금합니다.
= 저는 그런 경험이 이해가 안되네요..
빠른 시간에 분무하고 바로 고온 처리하면 됩니다.
앞 실험에서 스파팅 크기도 바꿔 보고 혹시나 양이 적나 해서 2mg/ml BSA를 10ul 파이펫으로 한방울 점적해서 15% 황산을 처리해 구워는데도 갈색으로 변하지 않았다면 발색제가 적당하지 않다고 판단하면 될까요?
그럴 경우에 농도를 20% 올려야 할지 아님 다른 물질을 혼합해서 만들어야 하는지,그렇다면 이 때 어떤 물질을 어떻게 혼합해서 사용해야 할까요?
* 여러번 질문을 하게 되어서 죄송합니다. (_._)
이건 개인적인 경험입니다만, 제가 예전에 TLC로 steroid 확인을 해봤었는데, 그 때는 황산용액 50% + 메탄올 50% 조성의 발색제를 사용했읍니다.