이전 단계에 쓰였던 buffer가 interfere할 물질이 없고 enzyme이 activity를 보일 수 있는 것이라면 purify안하고 쓰실수도 있겠지요.
이런 조건이 맞지 않거나 혹은 어떨지 모른다면 purify하셔서 자르셔야겠지요.

제한효소처리는 plasmid보다 PCR산물을 사용하는 경우가 많습니다.
물론 genomic DNA를 하는 경우도 있겠지만
정제에 대해 질문하시는 분들중 대부분이 PCR후에 PCR산물을 제한효소 처리하시는 것을 질문하시더군요. 아마 plasmid를 얻기 위해서는 추출과정에 정제과정이 포함되어있고 PCR은 정제과정이 포함되어있지 않기 때문인 것 같습니다. 보통 PCR을 하게 되면 적어도 50ng/ul 농도이상의 산물을 얻게 되는데 100ng정도만 되어도 충분히 agarose gel상에서 보이기 때문에 PCR 산물 2ul만 있어도 눈에 보인다는 얘기가 됩니다.
그렇다면 제한효소 처리시 PCR산물을 많이 넣지 않아도 된다는 얘기가 되고 따라서 제한효소의 반응에 영향을 미치는 염농도나 pH 그리고 Mg농도에 큰 영향을 미치지 않는다는 얘기가 됩니다. 따라서 PCR산물을 많이 사용하지 않는한 정제를 하지 않고 사용해도 별 다른 영향을 미치지 않는다고 말할 수 있습니다.

이전 단계의 버퍼시스템이 영향을 크게 미치는 효소반응의 경우 효소를 만드는 회사에서 reaction buffer를 2X 나 5X로 만드는 경향이 있습니다. 이렇게 만들게 되면 반응을 시키는 이전 단계의 산물을 상대적으로 적은 양만 사용하게 만드는 효과가 있기 때문에 10X대신에 2X나 5X를 사용하는 것입니다.

그리고 제한효소의 경우 어느 정도 조건만 맞으면 모두 잘리게 되어있습니다. 그만큼 충분한 효소량이 사용되어지고 크게 조건이 달라지지만 않는다면 왠만한 제한효소는 거의 모두 활성을 보이기 때문입니다.

이전 단계의 prep이 다음 실험에 영향을 얼마나 미칠런지는 실험자가 판단해야할 사항입니다.꼭 필요하지 않는 단계를 첨가하여 시간손해 그리고 샘플 손해를 피하시기 바랍니다.

바쁘신데...답변 감사드립니다. ^^
그런데... 저는 gDNA에 대한 PCR 산물을 가지고 restriction enzyme 처리를 하고 있습니다.
& purification 단계를 거치게 되니까(예전에는 잘 몰라서 그냥 PCR 산물을 가지고 enzyme 처리를 했었습니다) band가 너무 흐려서 DNA양이 많이 손실 되는게 아닌가 싶어 PCR을 20ul로 2판 하여 purification 단계를 거친 후 restriction enzyme을 처리하고 있습니다.(그래도 여전히 band가 흐리긴 하더라구요...T.T)
& 제가 쓰는 enzyme은 boineer 것인데... 10X buffer가 들어 있습니다
그래서 10X buffer 2ul + PCR product 15ul + D.W 2ul + enzyme 1ul(10U)로 4시간 반응을 하고 있는데요... 제대로 하고 있는 것인지를 모르겠습니다.
한스님의 말씀을 들으니 더 자신이 없네요...
혹시 제 조건 보시고.... 말씀해 주실게 있으시다면...부탁드립니다. ^^

PCR product의 경우라면 정제도 간단합니다.
사실 그저 buffer만 exchange하면 됩니다.
뭐 gel 걸고 그러실 필요도 없잖습니까.
정제시 잃어버리는 것이 많다면 사용하시는 kit의 capacity를 한번 의심해 보세요.
Q사의 경우 spin 형의 어떤 제품은 capacity가 낮아서 loading 양이 많으면 잃어버리게 되기도하고 마지막에 녹일때 볼륨도 늘어나게 되더군요.
그리고 restriction 시에는 volume을 더 늘여서 쓰셔도 별 문제 없습니다.

PCR산물이 어느정도의 양을 얻고 그래서 얼마나 써야하느냐에 따라 다르겠지요. 말씀처럼 gDNA를 쓰나라 잡다한 것들이 같이 들어갈 가능성이 많고 상대적으로 많은 양 (volume으로) 쓰는 경우는 정제를 하는 것이 좋습니다. 그리고 정제도 간단하구요. 비드형태의 것보다 컬럼을 쓰시는게 더 깨끗한 DNA를 얻게 됩니다. 그리고, 스핀 컬럼으로 정제하는 경우, 너무 적은 EB로 elution을 하게 되면 컬럼이 충분히 equilibrium이 안되서 그런지 회수되는 DNA가 더 줄어듭니다. 적어도 30uL이상의 버퍼로 회수를 하시는게 좋은 것같습니다.

그리고, 한스님의 말씀에 의문인 것은 몇X로 (5X든 2X든) 오든 버퍼를 쓸때는 1X가 되게 해서 쓰기 때문에 그런게 문제를 일으키거나 해결해주지는 않을 것같습니다.

아.. 그리고 보시는 PCR 산물이 너무 작은 사이즈 (몇백 bp정도)인 경우는 컬럼에서의 회수율이 상대적으로 떨어집니다. 스핀 컬럼에 쓰는 레진들은 반응에서 남은 프라이머라던가 기타등등의 잡다한 부산물을 제거하기 위해서 상대적으로 작은 사이즈 (특히 150bp이하)의 DNA결합이 거의 힘들게 되어있습니다. 혹시 작은 사이즈의 산물이라면 정제하는 법이 따로 설명되어 있고, 아니면 아에 그에 맞는 키트가 있습니다.

그리고, 어떤 조건 반응이냐에 따라 다르지만, 저는 정제를 꼭 하는게 좋다는 입장입니다. 프라이머, dNTP 그리고, 템프에서 (특히 gDNA니) 따라온 물질들.... 생각보다 반응이 안될려면 안되게 만들 요인들이 너무나 많습니다. 물론, 그냥 한가운데 사이트가 있는 효소를 간단히 처리해서 젤에 걸어 마구 보는 High-throughput이라면 얘기가 또 다르지만요 (그리고, 또다시 물론... 그런 경우를 위한 96웰 포맷의-또는 384웰- 정제키트도 있지만요)

제 경우 gene이 universe하여 동일한 사이즈이지만 다른 염기서열을 갖고 있는 유전자를 cloning 합니다. clone library 전체를 시퀀싱하기 전에 insert를 PCR 증폭하여 RFLP 후에 동일한 RFLP pattern을 보이는 clone을 선별해서 gropuing을 하고 시퀀싱을 합니다. 따라서 하나의 clone library당 100-400개의 clone을 선별해야 하기 때문에 정제과정을 첨가하게되면 시간과 비용측면에서 불리하기 때문에 정제과정은 생략하였으며 정제과정이 RFLP 패턴 결정에는 큰 영향을 미치지 못하였습니다. 따라서 정제과정이 필수적이지 않다고 답변드렸습니다.

제 증폭산물의 크기는 2kb 정도이며 제한효소는 4bp를 인식하는 효소를 사용합니다. 보통 PCR 산물 5ul와 제한효소 5unit(0.25~0.5ul, 보통 효소는 10~20unit/ul)처리하고 최종volume이 20ul되도록 하고 효소처리후에 10ul를 전기영동에 사용합니다. 확률적으로 2kb안에 특정 4염기를 인식할 수 있는 부위가 존재할 확률이 3~5개정도이니 절편이 4~6개정도 생성되며 그 크기는 거의 1kb이하의 사이즈 입니다.
이런 RFLP 절편을 육안으로 확인하려면 PAGE 해상도를 갖는 gel을 사용하여야 하지만, 이전에 브릭질답게시판에 소개된 SB 버퍼를 이용할 경우 일반 agarose gel로도 뛰어난 해상도를 보이는 RFLP pattern을 얻을 수 있습니다. 키워드를 SB buffer로 하고 검색해보십시오.

위에 크림슨님도 답변하셨지만 증폭산물의 크기가 200bp이하인 경우 컬럼정제 회수율이 50% 이하로 떨어집니다. 하지만 200bp를 RFLP하는 경우는 드물기 때문에 PCR 산물 크기가 작지는 않은 것으로 판단됩니다.(aod님께서 질문하신 정보가 부족하여 정확한 답변이 어렵습니다. 적어도 PCR 산물의 크기와 제한효소의 종류만이라도 알려주셨다면 좀 더 답변하기 쉬웠을 수 있을 것 같네요.)

오히려 정제후 농축하기보다는 PCR 조건을 조절하여 PCR 증폭산물을 더 많이 얻을 수 있도록 하시는 것이 나은 방법일 것 같습니다.

크림슨 님께서 5X나 2X를 사용하는것은 최종적으로 1X가 되기때문에 별반 차이가 없을 것이라고 하셨는데.. 제가 답변을 좀 난해하게 했나봅니다. 제 얘기는 buffer를 5X나 2X를 사용하면 상대적으로 PCR product를 적게 사용하게 만드는 효과가 있다고 말하고 싶었던 것이지.. 버퍼의 최종 농도 변화를 얘기한 것이 아닙니다. 10X buffer를 사용하면 20ul 반응용액에 10X buffer를 2ul만 넣고 나머지 18ul중에 효소1ul를 제외한 17ul를 PCR product로 채운다면 buffer시스템에 영향을 미치게 되므로 2X와 같은 효소버퍼를 사용하여 상대적으로 PCR product를 적게 쓰도록 유도하는 걸 얘기하고 싶었는데.. 쩝.. 의사전달에 문제가..ㅜㅜ

제 PCR product size는 1.3kb이고, 제한효소는 PvuII와 XbaI을 각각 처리하고 있습니다. 도움 부탁드립니다.

& 한스님께서 말씀해 주신대로...SB buffer로 search해 보았는데....
아무 자료도 나오지를 않습니다. 제가 뭘 잘 못 찾은 갈까요..?? T.T

모두 6염기를 인식하는 효소이군요.
6 bp의 염기서열이 나열될 수 있는 확률을 계산하면 1/4096 이고 4 bp의 염기서열이 나열될 수 있는 확률은 1/256 이 됩니다. 즉 4096개의 염기서열중에 6bp가 한번 일치할 확률을 갖고 256개의 염기서열중에 4 bp가 한번 일치할 확률을 갖는다는 의미이지요. 이렇게 본다면 1300개의 염기서열을 RFLP처리할 때 4 bp를 인지하는 효소를 사용한다면 1500 ÷ 256=5.07 약 5곳이 존재하기 때문에 평균 6개 정도의 단편이 생기지만 6bp를 인지하는 효소는 4096개 염기마다 한번씩 존재할 확률이기 때문에 1300 ÷ 4096 = 0.31 이니까 0.3번정도 일어날 수 있기 때문에 효소에 따라 cutting site가 존재할 수도 있고 아닐 수도 있기 때문에 4 bp를 인지하는 효소를 사용하는 것이 바람직할 것입니다.…
따라서 aod님의 경우 6염기 인식효소를 사용할 경우 잘리지 않을 확률이 높기 때문에 잘리지 않는다면 그냥 1300bp 사이즈의 PCR product만 보이게 될겁니다. 만일 RFLP를 한다면 4염기인식효소를 사용하여야 합니다.

2개이상의 다른효소를 사용하는 이유는 한개의 효소 처리에 의해 동일한 RFLP pattern을 보이는 클론이라도 시퀀스가 다를 확률이 존재하기 때문에 이러한 확률을 감소시키기 위해서 2개 이상의 enzyme을 처리하여 분석의 신뢰도를 높힐 수 있습니다.

여기까지는 4bp 인식하는 효소를 사용하여야하는 이유인데.. 6염기 인식 효소를 사용하시는 특별한 이유가 있으시겠지요. 이미 알고 있는 시퀀스라던지..

하여간 SB buffer는 이전게시판에서 찾으실 수 있을겁니다.
다음에 링크합니다.
http://bric.postech.ac.kr/cgi-bin/newboard/CrazyWWWBoard.cgi?mode=read&num=22294&db=board&fval=SB%20buffer&backdepth=1


마지막으로 1.3kb라면 정제시 회수율이 감소되지는 않을 정도의 크기 입니다. 따라서 band가 보이지 않는다면 PCR이 잘 안된 것이라고 생각되어집니다. 그럼..

너무너무 감사드립니다.
바쁘실텐데...정말 감사합니다. ^^

저는 RFLP를 처음 해 보는건데요....
어디 도움이 될 만한 책이 없을까요..??
있으시다면... 추천 좀 해 주세요. 분자생물학... 을 찾아보니.. 그냥 원리와 예 하나만 떨렁 나와 있어서... 실험을 하는데는 턱 없이 부족함을 느낍니다. 어디 물어 볼 사람도 없고...T.T

& 저희는 다른사람의 논문을 보고... 저희도 적용이 가능할까..하여 시작해 본건데(병증은 다르지만...그 primer의 바탕이 된 호르몬 sequence가 저희 병증에도 영향을 미치는 호르몬이라 생각하여 저희 것에서도 결과가 나오지 않을까하여...), 처음엔 그 primer로 PCR 결과도 아주 잘 나왔었습니다.
근데...PCR 기계가 고장(Applied Biosystem사 제품)이 나서 MJ PCR machine으로 실험을 시작했는데...
같은 조건에 같은 primer로 실험을 하는데도 product band를 찾을 수가 없었습니다.
(PCR 회사 사람들 말에 의하면... 회사마다 온도 control 방식이 틀려서 그렇다고 하던데요...)
그래서 여~~러 회사의 premix(저희 실험실에서는 먼저 실험하시던 분들도 모두 premix를 사용했던데다가...sample 양이 많아 premix를 사용할 수 밖에 없었습니다)를 가지고 여러 조건으로 실험을 하여 수개월만에 band가 뜨기는 했으나....
약간 조건이 맞지 않는지 또~렷한~!! 결과를 볼 수는 없고... 약간(살짝) 아래쪽으로 끌리는 것도 있고, band가 약간 흐린 것도 있습니다.

그것을 가지고 처음에는 RFLP를 잘 몰라서 purification 단계를 거치지 않고 restriction enzyme을 처리(그것도 그 논문에 나왔었던 효소들입니다) 했었는데요...
나중에 정제를 해야한다는 것을 알고 PCR 3~4판 정도를(= 20ul*3~4 & 위에서 말씀 드렸던바와 같이 band가 정제와 효소 처리 후에 더 흐려지는 것 같아서요..)정제해서 restriction enzyme(10U)을 처리했습니다.
지금 결과를 보면... 잘리는 것도 있고, 잘리지 않는 것도 있습니다.
PCR product size는 1.3kb이고 PvuII 처리한 것은 850과 450bp로 & XbaI으로 처리한 것은 900bp, 400bp로 잘린다고 논문에 나와 있던데,

제 결과는..... PvuII의 경우
1) 1.3kb
2) 1.3kb, 850bp, 450bp
3) 850bp, 450bp
4) 1.3kb, 850b (아래 band가 잘 안 보인 것이 아닐까요..?? ^^;)
의 경우가 나오며,

XbaI의 경우도 잘린 size만 틀리고 이런 양상으로 나옵니다.

과연 이게 제대로 되고 있는건지 답답하기만 합니다.
한스님~!! 바쁘시겠지만....한 번 살펴 봐 주시고...
혹시 제가 실수하고 있는 것이 있다면 지적 부탁드립니다.
너무너무 감사합니다.

RFLP를 이용하여 유전형 확인을 하려고 하시는군요.
특정호르몬을 검출하는 프라이머로 호르몬 유전자를 증폭하는 것이겠구요.
사용하시는 프라이머가 얼마나 specific하게 target gene을 증폭하는지는 모르겠습니다. 다시 말해서 primer가 다른 부위에도 anneal되어 unspecific amplification을 한다면 원하는 RFLP pattern이 나오지 않을 수도 있습니다. 이미 논문으로 검증이 된 프라이머라고 말씀하실 수 있으나 positive control과 negative control로 확실히 PCR 조건을 optimize 하시는 것을 권장합니다. PCR의 기계에따라 온도조건이 다를 수 있습니다. gradient PCR로 최적 anneal 온도만 찾는 작업을 하셔도 큰 도움이 될겁니다.
제가 볼 때는 정제 문제 이전에 PCR 조건먼저 찾으셔야 할겁니다. 더군다나 premix를 사용하셨으니 논문의 실험 조건을 그대로 따라 하기 어려웠을 것이라고 생각합니다.

RFLP는 그 이후에 생각하시고.. 우선 PCR 먼저 해결하십시오.

그리고 사용하시는 임상 sample의 경우 혈액이나 조직을 제일 많이 사용하는 것으로 알고 있습니다. template DNA의 purity와 농도도 PCR에 큰 영향을 미칩니다. house keeping gene을 증폭하는 프라이머로도 증폭이 잘 되는지 확인도 하시는 것이 좋습니다. 만일 이 역시 증폭이 안된다면 sample 문제일 가능성도 생각하시구요.

근데.. 제가 궁금한 점은 PCR primer가 특정 호르몬만 증폭하는 프라이머라면 왜 RFLP로 한번 더 확인하는지요? 혹시 다른 유전자도 증폭되는 것이라서 RFLP를 첨가해서 확인하려는 것인지요?

한스님~ 정말 감사합니다.T.T
근데... 죄송하지만.... 너무 무식한 말씀이지만....
(제가 원래 유전자를 하던 사람이 아니라서요...T.T)
제 실험에서는 positive control은 정상인이고... negative control은 환자 것이 되는건가요...??? T.T;;; 어떻게 구별을 하는건지요...??

& house keeping gene을 증폭하는 프라이머로도 증폭이 잘 되는지 확인하라 하셨는데..
그 primer는 어떻게 design해야 하는건지요...T.T

& 저희 실험에 참고한 문헌을 첨부하오니 바쁘시겠지만.... 한 번만 봐 주시면 감사하겠습니다.
&... 혹시... 어제 문의 드렸던..RFLP에 관한 책은 없는지요?

정말 감사 드립니다.

보통 PCR에서 positive control이라고 하는 것은
사용하는 프라이머로 증폭이 되는 목적 유전자를 PCR주형으로 사용하는 경우를 말합니다. 즉 PCR 자체에 문제가 있는지를 알아내는데 목적이 있습니다. positive control을 사용하면 필히 band가 증폭되어야합니다. 만일 증폭이 안된다면 PCR 조건 자체에 문제가 있다는 것을 알아낼 수 있습니다. 보통 목적유전자를 클로닝해서 사용하기도 하고 그게 여의치 않다면 확실히 그 유전자가 들어있는 DNA를 사용하는 것이 좋습니다.

반대로 negative control은 필히 증폭이 안되어야 하는 DNA를 말합니다. 어떤 경우는 DNA를 첨가하지 않기도 합니다. 이 컨트롤은 PCR 시약이 오염되었는지를 판단하는데 목적이 있습니다. 이 반응에서는 밴드가 증폭되면 안됩니다.

house keeping gene을 증폭해보라는 것은 현재 사용하고 계시는 DNA에 문제가 있는지 알아보기 위함입니다. house keeping gene(essential gene)이 문제없이 증폭된다면 DNA도 별 문제가 없다는 의미로 해석할 수 있습니다.

거의 PCR을 확인하기 위한 작업을 말씀드린 것이고 이런 작업을 통해서 프라이머의 이상유무라던지.. template DNA의 이상유무를 판단할 수 있습니다.
이렇게 PCR 조건이 잡힌 후에 RFLP를 들어가셔도 됩니다.

그리고 RFLP는 찾아보셔서 아시겠지만 restriction fragment length polymorphism의 약어입니다. 보통 시퀀싱을 하는 것이 정확하지만 샘플의 양이 많을 경우 시퀀싱대신에 RFLP로 유전자의 다형성을 결정합니다. 다시말해서 band pattern이 다르면 다른 염기서열을 가진다는 것을 알 수 있습니다. 결과적으로 같은 pattern을 보이면 같은 염기서열일 확률이 높다는 것을 의미합니다. 이런식으로 genotyping을 하게 되면 시퀀싱을 할 필요없이 RFLP만으로 유전형을 결정할 수 있습니다. 물론 시간도 빠르고 경제적으로도 유리하고 시퀀싱만큼 결과의 유의성도 높기때문에 많이 사용하고 있는 genotyping technique중 하나입니다.

별다른 것은 없으며 aod님의 경우 PCR후 효소 처리만 하면 됩니다. 대신에 PCR이 특이적 반응에 의해서 증폭되었는지 아닌지 알아야 합니다. 그러려면 PCR 조건이 잘 맞아야 하구요.