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 전체 > Molecular Biology-DNA > Southern Blot Analysis
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질문 Dig 으로 Northern 하기...
아자아자!  | 2009.09.10 09:34
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)

안녕하세요
혹시 로? 제품 Dig hybrid 방법으로 detection 해보신분 조언부탁드려요

다름이 아니라
제가 속한 연구실에서는 암실이 확보되지 못한 관계로 NBT/BCIP 를 이용해서 membrane에 color로 band 를 확인합니다. 
그동안 southern 은 아무런 문제없이 잘 진행되었는데, northern을 하려다 보니 결과가 안나오네요

사실 northern용 kit 는 따로 있더군요
하지만 들여다 보면, 마지막에 detection 방법이 CDP-star 를 이용한X-ray 발광방법인거 말고는 유사하길래 그냥 그동안 방법대로 밀고 나갔습니다. 

역시나 실험결과는 꽝이구요

해서 완전히 실험을 뒤업어야 하나 약간 변경하여 해 보아야 하나 고민중입니다. 

Northern 은 반드시 X-ray 발광방법으로 detection 해야 하나요?

그렇다면 RT-PCR 쪽으로 완전히 전환해야 할듯하네요....
선택의 기로에선 저에게 조언 부탁드립니다.

#Dig
 
#northern
 
#detection
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2009.09.10   
DIG-labeling kit로 Northern blot을 일본에서 자주 사용했는데 detection잘됩니다.
개구리rnl  |  2009.09.10   

NBT/BCIP같은 경우는 probe를 조직에 적용시키는 in situ hybridization에 많이 사용합니다.
메뉴얼 보시면 아시겠지만 여러과정을 추가 진행해야하죠...
그 방법을 northern에 적용하면 과정도 복잡하지만 가장 큰 문제는 film에 detection하기가 힘들죠. 그냥 육안으로 detection하는 것이라 보심 됩니다. 조직에 붙은 probe들이 검정색혹은 진한 파랑색으로 보여지고 그걸 현미경을 통해서 사진도 찍고 분석하는데 많이 쓰입니다. CDP-star를 사용하는것과는 또 다른 문제입니다.
northern은 반드시 x-ray발광방법으로 detection하는 질문은
northern이건 western이건 film에 현상을 한 data를 가지고 분석하는것이라...

암실이 문제라면 빛을 잠시나마 차단시킬 수 있는 공간을 확보해서 하시는것이..
DIG로 northern 효율은 전적으로 probe를 어떻게 잘 만드냐에 따라 달려있지만
효율은 제 경험상 상당히 좋았습니다.

RT-PCR하실 수 있는 여건이라면 몇일 잡아먹으면서 손많이 가는 northern보단 RT가 더 좋을 듯 하네요

전데요...  |  2009.09.10    
SPEED 님
잘 된다 하심은...  역시나 x-ray 발광방법을 말씀하시는 것이지요?

membrane에 band 가 보이는 방법은 아닌것이지요?


확인 부탁 드립니다.  혹시 제가 hybrid 온도를 잘못 맞춘게 아닌가 생각도 들어서 다시 해볼까 고민중이거든요...


그리고 지금 RNA membrane이 잘 만들어져서 RT-PCR이 조금 더 손이 많이 가네요...  ^^;;

대왕개구리SPEED  |  2009.09.10   
로슈의 DIG-labeling kit에는 화학발광 방법과 발색방법 두가지가 있습니다.

화학발광은 Film이나 ChemiDoc 장비를 사용하여 읽을 수 있고 발색 방법은

눈으로 바로 읽을 수 있습니다.

DIG kit는 isotope을 사용하는 것 보다는 감도는 떨어 지지만 mRNA발현 pattern분석하는데는

큰 문제 없이 사용가능합니다.

그리고 northern이나 RT방법 모두 단계를 많이 거치는 실험이지만 저는 RT가 덜

번거로운것 같습니다.
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