그렇습니다. 한번 정제해서 깨끗한 넘으로 쓰세요.

답변 감사드립니다. ^^
그런데... 정제 한 것 가지고 수행한건데... 이럴땐 어쩌나요...???
농도를 높이거나 시간을 늘리면 괜찮을까요..??

그렇군요. 제가 정제를 제일 먼저 말씀드린게, 피시알이나 키트를 안쓰고 미니프렙을 한경우 salt도 많이 남고, 버퍼조성이 변화해서 효소가 잘 안듣기 때문입니다.

그렇다면, 반응시간을 늘려야하는데, 무슨 효소인가요? 말씀으로 보면 가운데에 있는 사이트에, PCR 산물이니 직선인 DNA라.. 이런 경우는 왠만한 효소라면 광속으로 잘라주는데요.....

PvuII와 XbaI 각각 입니다.(아까 말씀 드린건 이 중 하나였습니다만 가닥이 PCR product까지 다 나타나는 반응은 이 두 enzyme 처리한 것 모두에서 나타나네요..T.T)

PCR은 human blood 유래 genomic DNA를 쓰구요...
Restriction enzyme 처리하고 나면...
1) 1300b, 850, 450
2) 1300
3) 1300, 850
4) 850, 450
sample에 따라서 이렇게 세 가지 유형의 band가 나타납니다.
어찌해야 할까요...??
enzyme은 10U로... 4hrs씩 처리하고 있습니다. T.T

두 효소 모두 광속으로 자르는 효소들입니다. XbaI의 경우는 dam 메틸레이즈의 영향을 받지만 이경우는 PCR 이라서 전혀 고려할 필요가 없고....

결론은 혹시나 PCR 중에 효소사이트에 변이가 들어간 경우를 생각할 수있지만, 그정도의 크기로는 평균 하나에서 두개정도의 변이가 들어갈 텐데.. 그게 효소 사이트에 집중되어 있다는 것도 말이 안되네요.

효소를 조금 더 (뭐 그래봐야 늘 1 uL지만) 쓰시고, 반응을 1시간에서 2시간정도 해보세요.


그리고, 혹시나 해서 드리는 말씀인데... DNA를 얼마나 쓰시나요? 너무 많이 쓰면 (효소의 활성을 압도할 정도로...) 효소가 잘 안먹습니다.

그런데, 직접하시는 분이 가장 심사숙고해서 하실테니... 옆에서 보지 않는한 이유를 모르겠네요. (혹시 옆방에서 좀 빌려서 써보세요. 누가 freezer 문을 밤새 열어놔서 효소가 죽었는지도 모릅니다)

이렇게 실시간으로... 감사합니다..T.T

저희 sample이요... 환자들꺼라... 환자들 것과 정상인간의 RFLP를 보는 실험이거든요..!! (아직 정상인들 것은 해 보지 않아 pattern을 잘 모르겠지만....)
환자들 것이 이런 pattern으로 나타날 수도 있는건 아닐까요...??? (그치만... 안 잘린건 절대 아닌거 같긴 합니다만..???? 처음 해 보는 것이라 잘 모르겠습니다 T.T)
암튼 너무너무 감사합니다. 바쁘신 시간 내서 이렇게 조언 해 주셔서요..T.T
감사합니다.

참~!! 바로 위의 질문에 이어 질문 하나만 더 드릴게요...^^;
보통 restriction enzyme 처리하실 때.... PCR product와 buffer & restriction enzyme의 비율을 어떻게 해서 사용하시는지요..??
저는 PCR product 15ul
+ D.W 2ul
+ 10X buffer 2ul
+ enzyme 1ul 이렇게 하는데....

전체 반응 volume에 비해 pcr product의 양이 너무 많습니다.
동일 반응 volume에 product의 양을 줄이던가 (5ul 정도로)
전체 반응 volume을 늘려보세요.
현제 20ul인데 30~40ul 정도로..
두가지 동시에 시도해보셔도 됩니다.

enzume을 많이 사용해도 알수없는 inhibitor들에 의해
효소 반응이 일어나지 않는 경우가 있습니다.

아마도 바빠서 이게 마지막으로 들른게 될 것같습니다만, 제로님 말씀대로 효소나 DNA를 너무 많이 사용하면 반응이 잘 일어나지 않는 경우가 많습니다. 효소의 경우는 냉동고 보존을 위해 넣어주는 글리세롤자체도 많은 효소반응을 저해하는 물질이고, 또한 보존용 스톡이 담겨진 버퍼와 반응용 버퍼가 같지 않은 경우도 많습니다.

그리고, 위에서도 말씀드렸듯이, DNA를 너무 많이 사용해도 효소반응이 잘 가지 않습니다. 다만, volume자체는 저로서는 뭐라 말씀드리기 어려운게, 분명히 purify하신 PCR 산물이라고 하셨으면 아마도 그냥 pH8짜리 Tris 버퍼 (Qiagen의 EB)에 녹여있을텐데, 이 버퍼의 경우는 대부분의 효소반응을 저해하지 않아서 그냥 DW하고 동일하게 사용가능합니다. 다만, 저 말씀하신 15uL안에 얼마나 많은 양의 DNA가 존재하는지는 좀 문제네요. 떡이 아니고 샤프한 밴드가 보일정도의 양으로 줄여서 해보시구요.

또한가지는 위에 다셨던 RFLP 를 하신다고 하셔서인데... 그렇다면, 찾으시는 변이가 혹시 지금말씀하신 결과일수도 있습니다. 특히, 잘린 밴드와 안잘린 밴드로 나온다는 얘기는 한쪽이 환자의 시료채취시 오염된 것일수도 있구요. 그보다 haplotype이 아닌가 알아보십시요. 인간은 아시다시피 2N인데, 한쪽에만 변이가 있는 경우인지....

저희는 여건상 DNA 농도를 측정해 볼 수가 없어서 그냥 실험을 하고 있습니다.
근데요.... band가 그다지 또렷하지 않은 것 같고(DNA purification을 하고 난 후 약간 손실이 있는 것 같습니다)
& enzyme 처리 후에도 band가 약간 흐려지는 것 같아서 PCR 30~40ul 시킨 후 그걸 purification해서 enzyme반응 시키거든요.

위의 말씀드린대로인데....말씀해 주신대로 다른 조건은 동량에 이 sample(PCR product) 5ul을 넣고 실험해도 되나요?? ^^;;;

PCR후 정제과정 필요없습니다.
PCR하고나면 50~300 ng/ul의 PCR product를 얻을 수 있으며
여기서 5-10ul만 사용해도 충분한 band pattern을 얻을 수 있습니다.

10X buffer 2ul
enzyme 최종농도 5unit
PCR product 5ul
water make to 20ul
위와 같이 혼합후 반응시킨후 처리시간은 짧아도 괜찮지만
완전한 cut을 위해서 1시간정도 반응시키고..
여기서 5~10ul를 전기영동에 사용하는 것이 좋습니다.

정제를 하신후 정제한 양보다 적은 양으로 elution을 하였을 경우 농축이 되기 때문에 enzyme 처리가 안될 수 있습니다. DNA농도가 높을 경우 enzyme처리되지 않고 남아있게 됩니다.