mixed cellulose ester membrane filter (MCE) 여과지 필터에 아세톤을 멸균여과해도 될까요? 현재 PTFE는 없고 MCE와 CA가 있는데,, 이 중에 뭘 사용하는게 좋을까요??  

cas9 방법으로 cell에 형광이 발현되도록 GFP gene을 삽입하였습니다. transfection 후 나온 cell에서 gDNA를 뽑아서 일부분을 PCR로 확인하였는데  막상 현미경으로 보면 GFP가 발현이 잘 되지 않고 있습니다. 그래서 gDNA을 뽑은 것을 시퀀싱을 보내고 싶은데 전체 길이가 3kb정도 됩니다. PCR primer를 사용하지 않고 랜덤하게 Primer를 5~6개정도 짜서 전체 시퀀싱을 하고 싶은데 이게 맞는 방법인가요?    

CRISPR/Cas9 system으로 유전자 cloning 진행 중 입니다. target gene이 포함 된 vector는 제작이 완료된 상태고 다음 단계를 진행하려고 합니다.   delivery system을 lentivirus로 선정하여 진행하고자 하며, 가지고 있는 vector 정보는 아래와 같습니다. cloning vector : lentiCRISPR V2-GFP packaging, envelop vector : VSVG, psPAX2   알아보니 lentivirus production에 사용하는 reagent 정보를 알 수 있을까요? reagent 정보에 vector 별 비율이 나온다고 하는데 적절한 reagent를 선정하지 못하고 있습니다.   HEK293T cell에 진행하려고 하는데 혹시 lipofectamine과 lentivirus용 reagent가 효율 차이가 많이 나는지도 궁금합니다.   참고하신 protocol 정보가 있으시다면 혹시 공유 부탁드려도 될까요? 감사합니다.   atonaema@kangwon.ac.kr

제가 Lentiviral 벡터를 클로닝 중인데, 클로닝이 너무 안되어서 질문 드립니다. 실험실에 가지고 있는 pLenti-vector를 이용하여 클로닝 중인데요. insert로 넣을 단편은 PCR로 증폭이 잘 되지 않아, 업체에 의뢰해서 gene 합성을 하였습니다. (벡터에 포함된 상태로 수령)  합성되어온 insert는 제한효소로 잘라서 gel extraction하여 정제하였습니다. pLenti-vector 역시 동일한 제한효소로 잘라서 gel extraction 후 정제하였습니다.  정제 후 insert(950 bp), vector(7.5kb) 모두 전기영동하여 순도확인하였고, 클로닝 진행하였습니다. competent cell은 NEB stable을 사영하였고, transformation 후 콜로니가 30개 정도 떴습니다. 그 중 콜로니 19개를 따서 colony PCR을 수행하니 증폭되는 밴드가 약하기는 하지만, 모든 콜로니에서 타겟 사이즈에 밴드가 증폭되는 것을 확인하였습니다. 이때 까지만 해도 수월하게 진행될 줄 알았는데...ㅠㅠ 그 중 콜로니 4개를 따서 mini prep해서 제한효소로 잘라보니 타겟 사이즈로 잘리는 게 하나도 없습니다. 상대적으로 크기가 작아 잘리는 양이 적을 수도 있을 것 같아 양을 많이 잘라서 로딩해서 확인해 봐도 동일하네요. control에서는 잘리는 밴드가 확인이 되구요. mini prep한 plasmid로 PCR 해 보면 증폭되는 양이 적긴 하지만 타겟사이즈 밴드가 보이기는 합니다. 물론 다른 밴드도 같이 증폭되기는 하지만... 몇 번을 다시 클로닝을 해도 동일한 양상으로 나타나는데 이럴 경우 어떻게 해야 될까요? 거의 3달째 이러고 있으니까 답답하네요. 그냥 업체에 클로닝 서비스 맡길까 생각도 들구요. 이런 경우는 어떤 부분을 확인해 봐야 될까요?

안녕하세요 이제 막 2달된 대학원생입니다... 저희 실험실은 cancer cell 을 주로 다루는데 이때까지 아무도 해보시지 않으신 SH-SY5Y cell 을 제가 처음으로 맡아서 하게 되었습니다.. 그래서 더더욱 공부도 더 해보고 하고있는데요.. 세포주은행에서 p.26 을 받아서 subculture 해 왔었는데 bacteria contamination이 되어서 stock 도 다 버리게 되었습니다..ㅠㅠ  심지어 같은 인큐베이터를 쓰시는 다른분의 cell 마저도 오염 되어서 죄책감이 진짜 이만저만이 아닙니다....하.... 저희 실험실에서 아무도 한번도 이런적이 없다고 하는데 왜 저만 이렇게 자꾸 세포가 오염이 되는걸까요 ㅠㅠㅠ 진짜 너무 스트레스 받네요.... 이번에 세포주은행에서 p.19 로 다시 한번 세포를 분양받았습니다.. 진짜 이번마저도 그렇게 되면 대학원 생활 어떻게 해야할지 모르겠습니다 ㅜㅜ Media, trypsin, DPBS, cell freezer 등등 필요한 것들은 다 버리고 새로 만들어서 다시 한번 해보려고 합니다... 다른분들과 하는 방법도 다 똑같은 것 같은데 대체 무엇이 문제일까요....실험 진행도 안되고 다른분한테 피해까지 끼치고 진짜 멘탈이 나가버릴것같네요... 어떻게 하면 cell contamination 을 줄이면서 심기일전 할 수 있을지.. SH-SY5Y cell 은 어떻게 cell culture 를 하면 좋을지 제가 다시 심기일전 할 수 있게 도와주세요.... 항생제 농도를 더 높여야 할지 어떨지 ㅜㅜ 여러가지 방법 등등이요!!도와주세요!!! Media 는 DMEM (low glucose) + F12 + 10% FBS + 1% P/S(항생제) + 1% non-essential amino acid 를 사용하고 있습니다. 참고로 media contamination 은 인큐베이터에 넣어보고 확인했을 시 문제는 없었습니다...

세포 동결보존을 할 때 세포 수를 정해놓고 보관을 하는데 그 이유가 궁금합니다

Paraffin block 제작 중에 문제가 생겨 글 올립니다. 파라핀 블럭 제작후에 시간이 지나면 저렇게 하얗게 ? 변하는데 저렇게 변하는 이유가 무엇인지 알수있을까요? 또한 저렇게 되면 결과에 문제가 생기나요? 조직병리 고수님들 도와주세요,,ㅠㅠ

실험을 하던 중 문득 궁금증이 생겨 질문드립니다. PBS와 DMSO를 1:1비율로 섞었을 경우 층분리가 일어나나요?

안녕하세요.   보통 1주 정도 주는 순화기간에 45%나 60% 고지방 식이사료를 주었을 때, 문제점 같은 것들이 있나요?

MSC adipogenesis 실험하는데 oil red o staining 실험을 하게 되었는데 회사에선 해본적 없는 실험이고 관련 자료가 없어 실험방법을 찾아보았는데 이게 맞는 방법인지 확인해주시면 감사하겠습니다!   1. 4% formaldehyde 1ml 넣어주고 10분간 RT 2. PBS로 2번 washing 3. ORO 1ml 넣고 15분간 RT 4. 증류수로 한번 washing 해서 제거하고 증류수 1ml 넣고 관찰.   뭘 더 추가해야하거나 해야할 게 있을까요..?   ORO solution이어서 녹일 필요는 없어보입니다. 시그마 사의 O1391-250ml 을 쓸겁니다!

안녕하세요. 박사과정 3년차인 학생입니다. 연구 중에 조직 샘플에서 유전자 발현분석을 하는 파트가 있습니다(RT-qPCR). 저희 학과에서는 학부생 졸업 논문을 대학원생들 일부 연구에 참여시켜서 실험을 함께하게 됩니다. Trizol 방법으로 조직 RNA를 뽑는데, 원리나 방법 교육하고 같이 몇번 분리를 해보며 노하우도 알려주었습니다. 그래서 일부 샘플 분리를 시켜놨는데,,,, 260/280 ratio가 1.4~1.8대로 나오더라구요. 물어보았더니 75% washing step 없이 DEPC treated water에 elution을 했더군요.. 생각을 해보다가 다시 precipitation을 해서 washing을 해주면 될 것 같다는 생각을 하게되었고, Cold Spring Harbor Lab protocol 중 RNA precipitation protocol을 찾았습니다. http://m.cshprotocols.cshlp.org/content/2020/3/pdb.prot101717.full Salt와 알코올을 첨가해서 다시 침전하는 간단한 procedure긴 하더군요. 몇 개 샘플로 시도를 해볼까 하다가, 많은 노하우들을 가지신 선배님들께 먼저 여쭙고 해보는게 도리인 것 같아 글을 남깁니다. ㅎㅅㅎ Cleanup kit들을 쓸 만큼 (비용적으로) 가치있는 샘플 같지 않아서, 위 과정을 시도해보려 합니다.  

80% 아세톤을 만들때 99.9% 아세톤에 증류수를 혼합하면 될까요??

전에도 질문드렸는데 헤매고있어서 재질문드립니다..ㅠㅠ..   96 well에 poly l lysine을 코팅 처리해야하는데 제가 붙이려는 cell의 모든 논문에 아래와 같이 기재되어있습니다. 96-well microtiter plate was coated with 100uL of poly-L-lysine solution (0.2%, Sigma)   0.2%의 poly l lysine을 100ul 처리한다고 되어있는데 아무리 찾아봐도 sigma에 0.2%는 없고, 대부분 다른회사도 0.01% 또는 0.1%를 판매합니다... ㅠㅠ   그리고 다른 프로토콜이나 다양하게 찾아보면 0.01%조차도 희석해서 사용하는 경우가 많은데요..   왜 96well 코팅에 0.2%의 고농도로 깔려야 하는건지.. 왜 모든 논문이 0.2%로 써져있는데 왜 안파는건지 모르겠어요 ㅠㅠ..   그래서 파우더로 구매해서 0.2%로 만들어야하나 했는데 파우더 조차도 0.01%로 제조해서 쓰라고 되어있더라구요.   ㅠㅠ...뭘까요 대체

새내기 대학원생입니다. 논문에 보면 TS와 VS 단위가 wt%로 나타나 있는 경우가 많은데 직접 측정할때 g/L로 측정을 하면 wt% 로 환산은 어떻게 하는게 맞나요?

궁금한 점이 있어 질문 드립니다. ^^ gel extraction 을 퀴아젠 키트(qiaex ii gel extraction kit)로 하려합니다. 프로토콜을 보니 스핀컬럼 사용이 없던데 gel extraction 할 때 스핀컬럼 사용하는거 아닌가요?  잘 모르겠어서 질문드립니다. 프로토콜 첨부 합니다.  

사람들이 흔히 돼지피부와 인간의 피부가 유사하다고 말하는데, 그렇다면 그 피부 중에서도 어떠한 부분(EX: 지방세포가 차지하는 비율) 이 비슷하여서 비슷하다고 하는건가요? 또 그러한 결과를 어떠한 실험 방법으로 알게 되는건가요?