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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Laboratory Animals > Surgery
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Q. 조직을 PBS에 담아 -70C 보관시 RNA 추출
LN2를 사용하지 않고 조직을 적출 후 PBS에 담아 -70에 보관하였습니다. 다시 녹여서 RNA를 뽑을 수 있을까요?
회원작성글 RNA 분리  |  2008.04.17
Q. 항산화효소 catalase 실험에서..
제가 catalase 활성을 측정하는 실험을 하려고 합니다.. 연구실내에 프로토콜이 있긴한데요 , 제가 작성한것이 아니라 헷갈리는것도 많고 이해하기 힘든것도 많습니다. 저희는 간을 적출하여 생리식염수로 여러번 세척한뒤 혈액을 제거한후, 간을 sucrose / EDTA (0.25M / 1mM ) 용액내에서 homogenizer로 분쇄하는 방법으로 10%의 균질액을 제작한다고 합니다.. 근데 여기서 궁금한것이 sucrose / EDTA (0.25M / 1mM ) 라는 말과 또하나는 10%의 균질액 을 제작한다는 말입니다.. 도통 무슨말인지 모르겠습니다.. sucrose 0.25mM과 EDTA 1mM 은 각각 준비가 되어있는데요,,,,, 총 량을 1 리터로 만든다면 ( 혹은 500ml) 어떻게 이 두 용액들을 얼마나 첨가해야하나요,,? 그리구 10% 균질액은 도대체 어떻게 만들어야 하나요?
회원작성글 조은주  |  2008.03.14
Q. 동물실험 claim 도움을 바랍니다~
보통 동물을 신청하고 7일전까지 하자가 생기면 동물을 교체하는 것으로 알고있습니다 저는 이번에 토끼를 구입하여 실험을 할려고 SPF female NZW rabbit(2개월령)을 주문을 하였는데 그중 2마리가 외상이 있어서 반품하여 다시 두마리를 받아서 실험을 진행하였습니다. 두마리는 외관상 문제가 없어서 나머지 토끼들과 같이 사육을 시작하고 관절염 유발(수술적)을 실시 후 각각케이지에서 꺼내어 풀어놓았습니다.(구입4주후) 그런데 애들이 많이 싸우는 것 같기도 하고 이상한 자세를 잡기도 하고 해서 애들이 발정이 나서 그런가 하고 무심히 넘기다고 4-5일 지나서 교미장면을 목격(--;)하였습니다. 혹시나 하여 성판별에 들어갔는데 (아플싸!!) male이 섞여 들어온것이었습니다.(새로 들어온 2마리중 한마리) 그동안 싸우고 이상행동이 이상행동이 아니었던 것이었습니다. 토끼에 관한 책을 찾아보니 교미행동시 특이한 반응이 그대로 맞았습니다. O회사에 연락하여 male이 섞여 들어왔다고 하니까 전문가가 구분해서 납품하니까 그런일은 있을수 없다고 하더라구요 그래서 와서 확인해 달라고 했지요. O 회사에 납품하는 Y회사에 연락해서 보내겠다고 하더라구요. 그런데 Y회사에는 자기들도 가끔은 실수를 한다고 하더라구요. O회사에서 그런일이 일어날수 없다고 하니까 와서 확인해 달라고 해서 Y회사 직원이 와서 male임을 확인하고 O회사와 상의해서 보상해주겠다고 하더라구요 O회사에서 전화가 와서 자기들의 잘못을 인정하고 보상을 해주겠다고 하고 토끼를 전량처분하기로 했습니다. 저희는 수술적기법으로 관절염을 유발하였기에 다시 세팅하기 위해서는 그에 준하여 똑깥이 세팅할 수 있게 요구하였는데 토끼만 다시 몇마리 더 플러스 해서 공급해줄수 있다고 하기에 어떻게 해야할지 답답합니다. 다시세팅할려면 인력과 소모품, 시간이 많이 소비되는데 깜깜합니다. 고수님들의 조언을 부탁드립니다.
pet  |  2008.01.18
Q. brain astrocyte primary cell culture에 대해...
제가 rat pup의 brain에서 primary cell (astrocyte)을 culture 할려고 하는데요... 막상 이런식으로 해서 깔린 cell들을 보니 media는 지저분하지 않은데 cell들이 지저분하다고 해야 하나? 예전에 보던 그런 cell모양이 아니고 cell 자체가 지저분한... cell 모양도 이상한것 같고.. 처음해봐서 익숙지 않아서 그런데요.. 해보신 분들께서 어느 부분에서 잘 못됐는지 알려주십사 하고요... 간단한 프로토콜을 써 드릴께요.. 틀렸으면 알려주세요.. 3. BRAIN을 꺼내서 수막제거후 CORTEX부분만 적출한다. 4. 적출한 CORTEX부분을 1X HBSS에 넣는다. 5. CORTEX를 잘게 조각낸다. 6. 조각난 CORTEX를 75cm2 flask에 총량이 10ml이 되게 1X HBSS를 넣고 80rpm에서 10분동안 교반한다. 7. 여기에 0.1% trypsin이 포함된 20ml 1x HBSS를 첨가하여 10~20 분 교반한다. ( 잘게 부서진 조직이 점성을 가지고 서로 붙을 때까지..- Total Volume-30ml) 8. 이렇게 점성을 보이는 primary cell을 10ml pipet으로 pipetting으로 분리시킨후 70um strainer를 이용하여 filtraion 한다. 9. 이렇게 모아진 cell은 800rpm에서 5분동안 원심분리한다. 10. 가라 앉은 cell에 30ml astrocyte media(20% fbs가 든 media)를 넣고 75cm2 flask에 seeding한다. 11. 3~4일에 한번씩 media를 바꿔주었으며 cell이 90~100%자랐을 경우 0.25% trypsin/EDTA로 계대배양 해준다. 이게 간단한 프로토콜이구요.. 음.. 9번에서원심분리해서 상층액을 버릴려고 하면 밑에 가라앉은 것들이 따라서 따라 오더군요... cell이 아닌것 같기도 하고... 그리고 1번 계대배양했는데 media는 20%fbs 든 media로 갈아 줬습니다.. 혹시 fbs 농도도 cell 모양에 영향을 주나요? 원래는 10% fbs가 든 media를 쓰는데 아직은 20%가 든걸로 쓰고 있는데 한번 계대배양하면 10%로 바꿔줘도 괜찮나요? 궁금합니다.. 뭐가 잘 못됐는지...ㅠ.ㅠ 고수님들 도와 주세요..ㅠ.ㅠ 속상해요...
고맙습니다..  |  2008.01.08
Q. human hepatocyte isolation중에 질문드립니다
간 수술 후에 떨어져 나오는 작은 간 조직에서 간 세포를 분리, 냉동보존하려 하는데 혈관 관류법을 쓸 수가 없는 상황에서 간세포 분리, 구획하는 방법을 좀 문의드립니다 워낙 왕초보인지라 상세한 설명 부탁드립니다^^
회원작성글 김태훈  |  2007.11.29
Q. brdu와 double IHC할때 백그라운드..
뇌경색 모델의 쥐를 brain을 적출하여 IHC 하는 실험을 합니다. 살아있는동안 BrdU를 주사하여 새로 분획하는 cell을 marking하고 IHC는 anti-budu(Accurate)와 각각 anti-NeuN, GFAP, galctocerebroside를 double로 하는데 일단은 signal들은 각각 잘 나오는 편입니다. 그런데 문제는 각각의 signal 이외에 모든 antibody signal에서 brdu signal이 전부 같이 뜬다는 것입니다. 예를들면 anti-brdu & anti-gfap같은 경우 brdu는 brdu signal이 뜨고 gfap는 gfap와 brdu signal이 전부 다 뜹니다. 물론 double stain이라 겹쳐지는 부분도 있어야 하지만 그런 수준이 아닌데다가 다른 안티바디들도 마찬가지 입니다. 혹시 이런 경험해보신 고수님들... 이를 헤결할 방안이 있는지... 부탁드립니다.
joon  |  2007.08.20
Q. mouse brain 통한 AChE assay 질문입니다.
안녕하세요. 제가 mouse에서 brain적출하고 homogenize 후에 AChE assay 진행하는데요. 결과가 계속 난감하게 나와 질문 드립니다. 그냥 프로토콜을 올릴테니 맞는지 확인한번 해주시고, 틀린점이나 스킬좀 지적해 주세요 ^^; 프로토콜은 제가 이논문 저논문 보면서 정리했구요; step 1. 5-6week mouse brain 절취 -> 전 뇌 전체를 적출해서 사용 떼어낸 brain을 homogenization buffer로 washing 버퍼는 12.5mM sod.phosphate + 400mM NaCl사용했구요 step 2. washing한 brain의 10배 용량 buffer를 가하고 homogenize 대충 10초정도합니다. step 3. centrifuged at 1,000g for 10min soln에서 supernatant 따로 분리 step 4. supernatant에 0.5% triton x-100(계면활성제) 첨가 triton x-100 첨가 후 supernatant stir. 20-30min step 5. centrifuged at 10,000g for 10min 원심분리후 supernatant를 enzyme source로 사용. (모든 과정은 4℃에서 진행) step 6. AchE assay 시행 실온에서 10분간 방치 후 흡광도 측정 (405nm) 뭐 보통 이렇게 진행하구요. loading할 AChE inhibitor 조제는 enzyme source 90μl + testing agent(10x) 10μl 실온에서 30분 배양 후 assay에 사용했습니다. 그러고나서 흡광도를 측정하는데 결과가 황당하게 나오네요. positive control로 AChE inhibitor로 시판되는 donepezil을 농도별로 해서 확인해봤는데 뒤죽박죽; 다른분것을 보니까 그냥 brain 에서 효소 꺼낼때 단순히 brain homogenize하고 1000g에서 한번돌려서 사용하는 분도 계신거 같던데 이게 효소 뽑기 더 좋은 방법인지 AChE 고수님들 답변 부탁해요 ㅠㅠ 혹시 사용하시는 protocol저랑 틀린거 있으시면 보내주심 정말 감사하구요. ssidra77@hanmail.net입니다. 더운데 모두 열심히 실험하세요.
회원작성글 klein`  |  2007.07.13
Q. 항산화 실험!
제가 이번에 새로 MCAO라는 허혈성 뇌졸중 모델을 가지고 약물의 효능을 평가하는 일을 맏게 되었습니다. 수술 하는 것 자체는 수련도에 따른거라 열심히 하면 되는 것 같은데요! 약물의 효능 기전을 알기 위해 여러가지 항산화 실험을 해야 될 상황 에 놓이게 되었습니다. 수술을 한 뒤 약물을 먹인 그룹과 대조군 그룹의 뇌를 적출 해서 SOD, glutathion peroxidase를 측정을 하려고 하는데요! 이들 manual protocol 있으신 분 답변 바랍니다. 구글에 찾아보니 죄다 kit사용 설명서라 kit를 사려고 여러 카달로그를 봤더니 값이 장난이 아니더군요! 100번 측정할 수 있다는데... 이쪽 관련 실험하시는 분들 꼭 좀 답변 부탁드립니다.
dementia  |  2007.07.09
Q. 인체에 무해한 DMSO
안녕하세요 DMSO 검색 중 인체에 무해한 DMSO가 있다는 답변을 보았습니다. 저희는 동물실험을 하고있는데요 가능하시다면 DMSO의 사양(제조사, 용량, 구매처 등)을 알려주시면 감사하겠습니다. - 아 래 - 작성자 : 이식센터에 있었던사람 (bmt9323036@hanmail.net) 추천: 2, 조회: 47, 줄수: 11, 분류: Etc. Re: 세포치료제 이식 KBB wrote: > 궁금한게 있어서 글 남깁니다. > 세포치료제를 판매하는 회사에서 그 세포를 병원에 있는 환자에게 이식을 하려면 동결되었던 세포를 이동시켜 수술실에서 해동시켜 바로 이식을 시키겠죠? 맞나요? > 그렇다면, 동결 처리를 할 때 사용되는 배지 및 DMSO는 인간에게 해롭지는 않을까요? > 만일 다른 동결용 특수 배지를 사용한다면 그 조성에 대해서 아시는 분 계신지요? ] 인체에 무해한 DMSO가 있어요 FDA승인을 받고 시중에 판매를 하고 있담니다 인체에 들어갔을때 약간의 부작용은 있지만 사람마다 다르고 부작용이 없는 사람도있어용
김은애  |  2007.05.07
Q. MFB 6-0HDA에 대해 꼭좀 답해주세요
LAT 식스 이거 찔렀는데 MFB에 애들이 비실비실하구요 좀 그런데 원래 이런건가요 제가 수술을 잘못한건지..그리고...언제 퍼퓨전하나요 뇌끄내는 시기가 언제쯤? 설마 4주는 아니겠죠..?? 답변해주시면 감사하겠습니다..
질문이 있습니다 꼭..  |  2007.04.21
Q. 셀에 관한 질문입니다.
저희가 이번에 rpe셀을 여러 약물을 주입하기전 레이저를 쬐어줄건데요. 그 레이저가 디쉬자체를 할 수가 없어 그냥 빛을 쏘이기로 했습니다. 그런데 그 등이 수술실에만 있고 수술실에 있는 건 밖으로 가지고 나올 수가 없다네요. 셀을 수술실로 이동할수도 없고.. 그래서 4mw/cm2의 등을 쏘이면 되는데 어떻게 하면 될건지.. 부탁드립니다.
happy  |  2007.04.06
Q. 잘라진 거 확인방법
벡터는 제한효소 자른 뒤 젤런하면 밴드위쪽으로 꽃의 수술처럼 길쭐길쭉한 모습으로 보여 잘라진 것을 알 수 있는데요 인설트로 쓸 DNA는 제한효소처리시 잘린 여부를 어떻게 알 수 있을까요? 벡터 인설트 잘 잘라져야 라이게이션 성공률이 높을 거 같은데...
++  |  2007.02.28
Q. 개에서 척수손상을 줄수 잇는 수술도구 및 기계?
개에서 척수손상을 줄수 있는 수술도구 및 기계가 어떤 것들이 있는지 알고 싶습니다.
곰때리기  |  2006.11.13
Q. rat hypothalamus primary cell culture 방법 좀 알려 주세요.
rat hypothalamus를 적출했는데, cell이 자라지 않읍니다. 좋은 방법 가지고 계시면 좀 알려주세요.
진철  |  2006.10.11
Q. 동결절편만들기에 대해..
장기를 적출한 후 아무런 처리 없이 액체질소에 담근 후 -80도에 저장해 두었는데 이 조직으로 동결절편하여 면역염색 할 수 있을까요? 그러니까 조직을 적출하자마자 OCT같은 동결포매제 외 다른 처리를 하여 동결 block을 만든 후 절편을 만들때까지 -80도에서 수개월 보관이 가능하다는데 아무런 처리 없이 -80도에 저장해둔 장기를 꺼내어 동결포매제 같은 처리를 하여 동결절편을 만들어 면역염색을 하면 결과가 나올 수 있을까요? 관심 부탁드립니다.
예은  |  2006.10.01
Q. IHC 로 c-fos 확인
rat brain 에서 immunohistochemistry 방법으로 c-fos expression 을 보려고 합니다. rat brain 을 적출한뒤, 4% paraformaldihyde 에 담궈놓는 과정이 있는데요. 조직을 4% PF에 담그는 시간은 IHC로 c-fos 발현을 보는데 전혀 영향이 없을까요? 사정상 4%PF에 2주정도 담궈야 하는 상황이 생겨서 질문을 드립니다. IHC 고수님들의 도움을 구합니다.
궁금한사람  |  2006.08.07
Q. Spinal Cord를 완벽하게 적출하는 법
Spinal Cord를 완벽하게 적출하는 법을 알고 싶습니다. 사용하는 동물은 wistar rat을 사용합니다. 목적은 Central Canal의 전자현미경적 구조에 대한 것입니다.
대학원생  |  2006.07.26
Q. Rat으로 Rota rod 해보신 분 계시나요?
제가 요즘 rat을 가지고 rotarod를 하고 있는데 쥐를 수술 하기 전 control기간으로 15~20일 정도를 적응 훈련 시킵니다. 1일 3회씩 실행을 하는데..(속도는 처음 아주 서서히 돌아가다가 점점 빨라지게 프로그램 맞춰놓고 실행합니다.) 원래 대게는 처음 며칠 적응 못해서 금방 떨어지고 잘 못하다가 점점 자기 실력이 나오기도 하고 더러는 처음서부터 일괄적으로 계속 잘 하는 쥐들도 있습니다. 근데 문제는 몇몇 쥐들이 잘 하다가 어느때부터인가 금새 떨어지곤 한는겁니다. 의지도 없어보이고 하기싫어하는것 처럼도 보이고.. 평균 200~300초 정도를 하던 애들이 갑자기 30~50초 만에 떨어지고 그럽니다. 이런 쥐들은 어떡해야하죠? 사용하지 않고 처분하기엔 평균 3~4마리당 한마리씩은 꼭 저러니.. 빼버릴 수도 없습니다. 그리고 control(적응훈련) 기간 중 평균적으로 walking time이 몇초정도 나와야 정상쥐라고 볼 수 있는것입니까? 제가 실험을 해봐도 천차만별이긴 하지만 대게 180~200초는 넘기고..좀 못하는 쥐들은 100초대 초반정도 나오던데.. 어느정도를 기준으로 잡아야 하는지도 궁금합니다. 아시는 분 계시면 답변 부탁드리겠습니다.
joon  |  2006.07.20
Q. rat 장기에 사용가능한 homogenizer는..?
늘 많은 정보 얻고 있습니다. rat의 장기를 적출해서, 액체질소를 이용해서 분쇄한 후 단백 또는 mRNA는 분리해야하는데요. glass homogenizer는 너무나 사용이 힘들어서, 전동 homogenizer 같은게 가능한지 모르겠습니다. 검색해보니, 사용 볼륨이 mL 단위인데요. 쥐의 장기 (폐, 심장, 간 등)를 갈아야해서, 볼륨이 아주 작아지는데 작은 볼륨에도 사용할 수 있는 전동(?) homogenizer가 있는지 궁금합니다. 비슷한 실험하고 계시는분 계시면 조언 부탁드릴께요. 감사합니다.
티슈  |  2006.06.12
Q. 조직고정에 관한 질문입니다..
전 mouse liver로 staining을 하고있는데요.. 간을 적출하면 4% paraformaldehyde에 24시간, 10%로 옮겨서 24시간 보관 뒤, embaddining 후 frozen section을 하고 있는데요.. 조직을 자르면 구멍이 뻥뻥 뚫리고, 조직이 수분이 다 빠진것 처럼 이상한 모양을 띄고 있거든요ㅜ.ㅜ 혹 고정방법이 잘못 되었나 해서요.. 다른분들은 고정을 어떻게 하시나요?
허접ㅜ.ㅜ  |  2006.05.21
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