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웹진 Vol.24, No.10 (2022년 10월) 발간
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Pull-down Assays
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
Cell Biology Microbiology Plant Biology Laboratory Animals
Omics Chemical biology Bioinformatics Laboratory Equipments
Buffer/Reagent Bioethics Etc.
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Q. RI detection 관련 질문드립니다 ㅠㅠ
이번에 RI(H3-SAM)를 이용해서 실험을 하였는데요저희 실험실에서는 SDS gel을 내린후에 쿠마시염색을 하고 enhancer처리후 gel을 말려 필름을 덮어두는식으로 실험을 하고있습니다.그런데 제가 깜빡해서...enhancer처리를 하는것을 잊고 그냥 gel을 말려버려서요...다른 실험실에서는 BAS라는 기계(?)로 RI detection을 하는것같은데 저희 학부에는 없는듯해서다른방법을 찾아보거나 하려는데 혹시 웨스턴 band를 찍는 Chemi DOC 은 있는데 이걸로detection이 가능할런지요..? 아니면 다른 방법이 잇을까요...
haavaa  |  2013.02.01
Q. protein degradation
  Tyrosine kinase인 B에 의해 A가 tyrosine phosphorylation 되고  tyrosine phosphatase인 C에 의해 dephosphorylation 되는 것을 보려고 했습니다… 그런데, WT C와 mt C(inactive form of tyrosine phosphatase)를 넣어 준 곳에서 A의 expression이 줄어드는 것으로나타났습니다.(IP와 total 모두)… 이런 경우 어떤 실험을 해야하는지요…MG132를 treat 해야 하나요? 참고로 A는 TLR signal에 관여하는 ubiquitin ligase 입니다.
궁금이  |  2013.02.01
Q. 3kDa 크기의 프로틴을 확인하는 방법이 궁금합니다.
SDS-PAGE 15, 18, 21, 24%까지 만들어서 분리해보았는데분리가 잘 안되는 것 같습니다.3kDa 크기의 protein 분리방법을 여쭤보겠습니다.
회원작성글 arrice  |  2013.01.04
Q. immunoprecipitation할 때 band가 겹칩니다...ㅠ
(편하게 말씀드리기 위하여) A와 B의 단백질 간의 interaction을 보고자 immunoprecipitation을 하였습니다. 먼저 agarose bead와 A antibody을 넣고 2시간 동안 4℃, rocking하여 incubation한 뒤에 cell lysate의 1mg을 넣어 overnight 동안 rocking하여 incubation하였습니다. wash는 pbs에 한 뒤sds-page로 내가 보고자 하는 B antibody로 immunoblot을 실시하였습니다.  다행이 제가 보고자하는 B 단백질 size에 band가 확인되어서 서로 간에 interaction이 있나 싶엇는데, 여러가지 control로 A antibody자체를 옆 lane에 control로 내려보았더니 또한 B antibody로 그 size에 잡힙니다. 물론 이러면 서로 간의 interaction하는지 모르는것 인데요, 여기서 제가 궁금한 것이 2가지 입니다. 1. 혹시 A 와 B와의 관계를 보려고 할때 다시 immunoprecipitation을 하려면 A antibody자체를 다른 것으로 바꾸면 달라질까요? ( 제 생각으로는 antibody자체의 kda이 150정도로 알고있는데 antibody을 바꾼다고 해서 달라질 것 같지가 않아서요)2. 그리고 polyclonal antibody말고 monoclonal antibody 의 A antibody을 사용해보라는 의견도 받았는데요, 보통 immunoprecipitation에서 monoclonal antibody로 사용하는 것이 더 좋은가요? 쓰다보니 우문인 것 같네요..ㅠ그래도 답변 해주신다면 진심으로 고맙습니다. ^^그리고 새해 복 많이 받으세요!
도와주세요~  |  2013.01.04
Q. physiological condition에서의 receptor-ligand interaction을 co-IP로 잡을 수 있을까요?
서로 다른 두 cell을 co-culture하는 상황에서한 cell에서 secretion 되는 chemokine(ligand)이 다른 cell의 receptor에 binding하는 것을co-IP로 확인할 수 있을까요?intracellular protein간의, 혹은 intracellular protein과 receptor protein 사이의 co-IP 실험은 많이 있는듯 한데, receptor와 ligand 사이의 interaction을 co-IP로 본 실험은 거의 본 적이 없는듯 해서 망설여 지네요.endogenous secretion 되는 양이 무지 적다면 잡기 어려울 수 있을 것도 같고..이 실험이 이론적으로 타당한지 여부를 알고싶구요혹시 관련 논문 알고 계시면 좀 알려주세요.만약 co-IP로 보기 어렵다면 physiological condition에서의 receptor와 ligand 사이의 interaction을 보는 일반적인 실험방법에 대해서도 알려주시기 바랍니다.
회원작성글 ahrehd  |  2012.12.05
Q. protein의 mol 농도 계산
안녕하세요protein mol 계산에 대해 질문드립니다.30.68 kDa의 protein을 10ug사용하였습니다. 사용된 10ug은 6ul의 solution이고요, 즉 10ug/6ul =  1.66ug/ul 입니다.이것을 몇 M인지 계산 (10ug = 몇 M)을 하여야하는데 어떻게 하여야 하나요?부탁드립니다
회원작성글 부탁드려요  |  2012.10.25
Q. pDEST27 vector 써보신적 있으신분
안녕하세요...이제 석사들어온 초보생입니다.GST pulldown을 하려고하는데 벡터가 promotor 부분에 CMV가 되어있는 mamalian expression vector이고요...NT에 GST가 달려있네요.이걸가지고 GST pulldown을 하려고하는데, 혹시 이 벡터로 pulldown해보신분 있으신가요.여러 논문을 보고 따라해봤지만 전혀 pulldown이 안되네요 (band가 아예 나오지않음)다른 벡터(pGEX-KG)로 pulldown했을땐 잘나왔었거든요.혹시 이거 사용하신적 있으신분 프로토콜좀 알려주실수있으실까요...꼭 좀 부탁드립니다.
초보입니다  |  2012.10.24
Q. 세가지 단백질의 interaction을 보는 방법?
Cell에 3가지 단백질을 transfection해서 interaction이 어떻게 되는지 볼 수 있을까요?지금 하려고자 하는것은 A와 B가 interaction하는데 C가 들어오면서 A나 B에 붙어서 A-B interaction이 사라질 수 있다는 가설 하에 실험을 진행하려고 합니다. 세포내에 3가지를 co-transfection해서 immunoprecipitation을 한 경우는 잘 없더라고요. 참고로, 박테리아에서는 발현이 잘 안되서 pull down assay가 좀 어려운 상황입니다. 경험 있으시거나 괜찮은 조언 있으신분 댓글 부탁드려요^^
ley  |  2012.10.08
Q. protein G bead!!
immunoprecipitation를 처음 하는 학생입니다. protein G bead 제품 추천 부탁 좀 드리겠습니다.
회원작성글 궁금이  |  2012.10.03
Q. TNT, pull-down, IP assay의 차이점
TNT(35s 사용), pull-down, ip 각각 의 차이점과 장단점에 대해 자세히 알고 싶습니다.실험적인 프로토콜과 그 원리에 대해서도 궁급합니다.자세한 설명 부탁드려요 ^^
초보  |  2012.09.27
Q. IP 고수님들..
안녕하세요..저는 A라는 유전자를 KO 시킨 마우스 샘플을 이용해 IP를 하고 잇습니다..WT 마우스와 A 유전자 KO 마우스ㅢ 조직에서 B라는 진의 mRNA레벨의 변화는 없는데 단백질의 양이 KO 조직에서 감소 하엿습니다.. A와 B의 결합을 보기 위해 WT 마우스의 조직 샘플과 KO 마우스의 조직 샘플을 A 항체로 IP 후 B 항체로 웨스턴 한 결과 WT에서만 밴드가 보엿습니다.KO 샘플과 IgG 에선 밴드가 보이지 않앗습니다.고민은 IP후 WT 샘플과 KO 샘플을 비교할 positive control이 없는거 같아요.. A로 WB 해도 KO 샘플에선 밴드가 얻어지지 않아서 안될듯하고, A와 B 둘다 결함하는 프로테인도 알려진게 없구요... 이 경우에 두 샘플다 같은 양의 프로테인으로 IP를 햇다는 것을 보여줄려면 무슨 실험을 더 해야 하는 지요?그리고, IP전 WB로 보면 WT 조직에서 B의 발현양이 현저히 많아서.. 제가 얻은 밴드가 정말 IP후에 얻어진 밴드인지 걱정이 됩니다..  혹시 샘플 lysate가 워싱이 덜되어 컨탬되어 남아서 WB로 B를 봣을대 밴드가 얻어지는 경우도 잇는가요?주위에 물어볼 사람도 없구 많이 답답합니다..두서 없이 물어 봐서 죄송합니다..
고민중..  |  2012.09.09
Q. immunoprecipitation과 co-immunoprecipitation의 차이가 무엇인 가요?
immunoprecipitation과 co-immunoprecipitation의 차이가 무엇인 가요?논문을 읽다보면, 이 두가지 용어가 서로 다르게 쓰이는 점을 밝견했거든요..저는 논문 상에서 뭐가 다른지 잘 모르겠습니다.혹시 알기쉽게 설명해주실 분 계신가요..ㅠ.ㅠ
회원작성글 궁금이  |  2012.08.29
Q. N terminal 분석 - C terminal 분석
CHO발현 단백질 분석 중에N말단 분석의 목적이 무엇인가요?N말단부근의 아미노산의 순서를 분석하는건가요?그리고,,,N말단분석은  단백질의 펩타이드 분석 및 아미노산 서열분석과는 어떻게 다른지요?마지막으로C terminal분석은 왜 힘들고 까다로운건지요?감사합니다.
낮은 자리  |  2012.08.28
Q. RhoA activity assay 해보신 분들께 질문드려요~
안녕하세요~ 아직 실험 초보입니다;제가 RhoA activity assay manual을 읽어보다가 생긴 의문점을 해결할 길이 없어 글을 올립니다.먼저, Lysate collection에서 lysis buffer를 넣고 cell harvest를 하고 난 다음에 centrifuge를 수행하고 그 다음 순서가 이해되질 않아서요;;;아래에 9번 과정이구요... 해석이 안된다는게 아니라 centrifuge를 수행한담에 다시 lysis buffer를 넣되 첨에 넣었던 lysis buffer 양의 130%가 초과해서는 안된다는 말인가요??5.  Lyse cells in an appropriate volume of ice-cold Cell Lysis Buffer 6.  Harvest cell lysates with a cell scraper.  It is useful to incline the culture plate for this method because the Lysis Buffer is spread thinly on the surface.  7.  Transfer lysates into the pre-labeled sample tubes on ice.  8.  Immediately clarify by centrifugation at 10,000 x g, 4°C for 1 min.  9.  At this point each lysate volume should not exceed 130% of the original Cell Lysis Buffer volume. 10.  Save at least 20 μl of lysate for protein quantitation and 20-50 μg of lysate for Western blot or ELISA quantitation of total RhoA. RhoA activity assay 해보신 분들께 답변 부탁드립니다.
회원작성글 초보  |  2012.08.19
Q. immunoprecipitation, 단백질이 잡히지 않습니다.
박테리아의 막 단백질을 연구하고 있는 학생입니다.표적 막 단백질의 다클론 항체를 주문 생산하였습니다.웨스턴으로 항원을 인식하는 것을 확인하였습니다.native form 단백질도 인식하는 것을 확인 하였습니다.co-immunoprecipitation 실험을 위하여 protein A 비즈에 항체를 붙이고,막 단백질이기 때문에 박테리아를 모아서 우선 lysozyme 처리를 하여 외 막을 용해시키고1% NP-40 으로 내막또한 용해 시켰습니다.비즈와 믹스하고 4도씨에서 O/N 반응 시켰지만...SDS, western 결과 non-bound fraction에 표적 단백질이 보이고 Elution fraction에는 보이지 않습니다.항체의 해비, 라이트 체인만 확인이 됩니다.어떤 이유로 항체에 결합을 하지 않는지 의견을 듣고 싶어서 글을 올렸습니다.detergent (NP-40)이 단백질을 전부 둘러쌓서 그런것일 수도 있는지요?또는 NP-40이 박테리아의 내막을 용해시키는데에는 적합하지 않는 것인지요?또는 NP-40에 의해서 항체가 기능을 못 하는 것인지요?부탁드립니다.
작성자  |  2012.08.17
Q. biotin binding protein은 size가 얼마나 증가하나요?
안녕하세요, biotinylation 하였는데, target band size가 크게 위쪽에도 나와서요, denature할 때 biotin binding protein이 bead에서 떨어질 때, biotin과 protein 결합은 떨어지지 않고 그대로 붙어서 protein size가 커지는 건가요?아니면 떨어지니깐 size는 원래 size 랑 같게 detection 되어야 하는 건가요?고수님들의 조언 부탁드립니다. ㅠ
상큼조교  |  2012.08.03
Q. IP
IP 를 처음 해 보고자 합니다.이전에 ChIP 해 본 경험은 있습니다.GE healthcare 의 immunoprecipitation starter pack (protein A, protein G) 를 사용합니다.cell lysis buffer 는 cell signaling 에서 나온 10x cell lysis buffer 사용합니다.cell lysis buffer 에 첨가물과 대략의 아니 좀더 디테일한 프로토콜 가지고 계신 분알려 주십시오.스스로 메뉴얼 읽으면 프로토콜 만들고 있는데고수님들의 경험도 듣고 싶습니다.
회원작성글 홈런타자  |  2012.07.26
Q. ubiquitination, IP관련 질문이 있습니다.
원래 ubiquitination을 했던건 아닌데..DNA가 돌아다니길래..제가 관심있는 protein, 편의상 A라고 하겠습니다.A랑 Ub랑 tfx후 IP해서보니 ubiquitination이 일어나는걸 확인했습니다.그뒤로 기본적으로, ubiquitination관련해서 논문나올때 나오는 data들 구색은 갖췄습니다.CHX치고보니..endogenous level이 unstable하고..K48 dependent하고, 어떤 약물치니 ubiquitination이 더 증가하고, degradation도 더 증가하고..요정도 data를 모았는데..A라는 단백질이 나쁜녀석인지라..A의 degradation이 clinical implication이 클거같아서..꼭 E3 ligase를 찾아주고 싶습니다..그래서 다마콘에서 나오는 E3 ligase SMARTpool siRNA도 사볼까했는데..600여개의 E3를 전부 스크리닝해보려면 약 2천만원정도 들겠어서..잠시생각을 접고있었는데..다른 접근을 해보려고합니다.먼저 좀 큰 scale로 GFP-A, HA-Ub tfx후..GFP로 IP..그후에 elution하여 그걸다시 HA로 IP한후2D해서 mass를...찍으면 E3를 찾을수 있을까요?걱정되는부분은..첫번째 IP후 bead에서 elution할때..complex등이 풀리지 않을까 하는점입니다.지금까지는 딱히 elution않고 sample buffer넣고 끓여서 바로 로딩했는데..아이피를 두번해야겠다는 생각을하니..complex를 풀리지않은범위에서 잘 elution해야겠다는 생각이 드는데..가능한 부분일까 싶습니다.혹시 이런 목적으로 elution하시는분 계시면 조성좀 알려주시면 감사하겠습니다.여러모로 많은 조언과 가르침 부탁드리겠습니다.감사합니다.
회원작성글 하늘을달려라  |  2012.07.24
Q. EPI300은 blast 돌려도 안나오나요?
안녕하세요~~좋은 아침입니다~~ 제질문은 E.coli EPI300은 blast돌려도 다른 E.coli 만 나오고 정작 EPI300은 안나오나요? 어떤분이 EPI300은 우리가 쓰기 좋게 개량한거라고 그래서 안나온다고 하더라구요,,,,, 알려주세요~~
날씨좋다  |  2012.06.20
Q. IP 밴드가 안잡혀요..ㅜ 고수님들 조언 부탁합니다.
셀을 NP40로 깬다음500ug 단백질을 정량하여 1차 안티바디를 24시간 붙이고..(IP가능 안티바디)magnetic bead를 이용하여 pull down 하여 denaturing buffer 첨가후 10분간 boiling 한후 western을 하는데10% input의 band는 진하게 잡히는데 IP한 band는 하나도 안잡혀요..ㅠheavy chain band가 잡히는것으로 보아 bead와의 결합은 잘 되는거 같은데..1차 안티바디의 문제일까요????
실험쟁이  |  2012.06.14
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