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웹진 Vol.24, No.10 (2022년 10월) 발간
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
Cell Biology Microbiology Plant Biology Laboratory Animals
Omics Chemical biology Bioinformatics Laboratory Equipments
Buffer/Reagent Bioethics Etc.
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Q. pcr 질문
안녕하세요.   real time PCR에 대해 질문이 있습니다.   보통 PCR에서 denaturation, anneling, extention 단계가 있는데 다른논문을 참고해서 primer를 짜려고하는데 조건이   95℃에서 15초간 변성(denaturation) 과정을 거치고 60℃에 서 45초간 결합(annealing) 반응을 시킨 후, 이러한 과정을 40회 반복하였다 라고 쓰여져있습니다.   extention 과정이 없는데 extention 과정이 없어도 되는거인가요..?   아니면 생략을 한거 일까요...?   추가적으로 다른 논문 PCR 조건에서는 50도 10분 + 95도 5분, 95도 10초 + 60도30초 39 사이클 조건이라고 써져있습니다.....여기도 extenion 조건이 없는데  없어도되는걸까요 아니면 생략일까요...
회원작성글 1045  |  2021.08.25
Q. qRT-PCR 그래프 해석 중 궁금한 점이 있어요 첨부파일
RNA prep하여 qRT-PCR을 진행하는데 앞에가 맞는 피크인데 자꾸 뒤에 다른 피크가 하나 더 뜹니다 (사진첨부) 왜그런지 알려주실 수 있나요?ㅠㅠ  계속 같은 primer에서 나오는 것 같다가도 간간히 다른 primer에서도 뜹니다.  원래 피크 앞에 생기는 것이 primer dimer라고 알고있는데 뒤쪽에 다른 피크가 생기는것도 primer dimer라고 볼 수 있는건가요? 그렇다면 primer 농도를 낮추면 해결될까요?
회원작성글 스으라아  |  2021.08.25
Q. cDNA 합성 시 qPCR 키트 사용해도 되나요?
CTAB으로 mRNA 추출한 후에 cDNA 합성할건데요 실험실에 qPCR 키트가 있는데 이걸로도 일반적인 cDNA합성이 가능한가요? 키트 찾아보면 qPCR용 키트와 단순 cDNA 합성 키트를 따로 판매하던데 특별한 이유가 있는지 모르겠어서요. 어차피 real-time도 mRNA에서 cDNA 합성하는 건 같은데 굳이 키트를 따로 파는 이유가 있을까요?
회원작성글 Perilla R.  |  2021.08.24
Q. RNA 펠럿을 만들어서 다른 곳으로 보내야 할 경우 문의 드립니다.
실험 초보에 물어볼 사람이 없어 브릭을 이용하고 있습니다. ㅠ_ㅜ   cDNA microarray 를 진행하기 위해 RNA 를 추출하거나 또는 RNA 펠럿을 전달을 해야 하는데요 .   RNA 추출이 어려운 경우 펠럿으로 보내라 하시는데    RNA 펠럿 상태로 보내기 위해서 아래와 같이 진행해도 되는지 문의 드립니다.    1) 디쉬를 DPBS 로 워싱 2) 트리졸 뿌린 후 클로로폼과 함께 센트리퓨즈 3) 상층액을 딴 후 isopropanol 과 함께 센트리퓨즈 4) 하단부 펠럿만 남기고 석션 5) 남은 펠럿을 트리졸(1ml)에 담아서 전달    펠럿을 트리졸에 담궈 줘도 되는건가요 ?  트리졸은 셀을 녹이는 거로 알고 있는데 제가 잘못 알고 있는 걸까요 ?    답변 부탁 드립니다. ㅠ       
회원작성글 바나나차차  |  2021.08.24
Q. 표준물질 copy 수 계산 (7.7 Log10 IU/ml) 첨부파일
안녕하세요   코로나 진단키트 성능 검사를 위해 표준물질을 받았는데요. 농도가 copy 수로 안나와있고 7.7 Log10 IU/ml로 표시가 되어있습니다. NIBSC에서 주문을 했는데, 이것을 copy 수 농도로 어떻게 변환하는지요?     구글에서 좀 찾아보니 변환 표가 있긴 하던데    https://i-base.info/log-value-conversion-table/   HIV에 대한 것이고, 이 표를 그대로 사용할 수 있을까요?   선배님들의 조언 부탁드립니다.    
회원작성글 Proteinman  |  2021.08.23
Q. RNA가 적게 뽑인 후 cDNA합성
평상시 RNA isolation을 하면 500ng/ul정도 나왔는데 20ng/ul정도 밖에 나오질 않았습니다. 추후에 RT-PCR 진행 예정인데 cDNA합성할때 20ng/ul으로도 합성이 가능할까요??
회원작성글 세라민B  |  2021.08.19
Q. THP-1 cell에 PMA처리
THP-1 cell에 PMA처리한지 72h 지났는데요 PMA처리 오래할 수록 세포에게 안 좋나요?
회원작성글 디구지키미  |  2021.08.05
Q. Single-cell analysis에서 quality control 체크를 할 때 왜 mitochondrial counts를 보나요?
안녕하세요, Single-cell 분석에 대해서 공부중인 비전공학생입니다. 제목에 적혀있듯이, single-cell analysis에서 quality check를 하는 방법중에 mitochondrial counts를 보는 방법이 있는데, 어떻게 미토콘드리아의 발현 정보로 cell의 quality를 알 수 있나요? 제가 읽은 부분은 cell이 죽으면 mitochondrial counts의 비율이 증가한다고 하는데 정말로 뭔가 over-expressed 돼서 비율이 증가하나요? 아니면 상대적으로 다른 요소들이 줄어서 비율이 증가하는 건가요? 읽어주셔서 감사합니다.
회원작성글 연어좋아  |  2021.07.31
Q. real time pcr 실험 관련
현재 Real time PCR을 이용하여 Sample의 knockdown 정도를 확인하는 실험을 진행 하고 있습니다. 실험하는 과정에 있어 문제가 생겨 글을 올리게 되었습니다. Real time PCR을 돌리고 나서 Ct값이 undetermined라고 값들이 계속 나오는데 이러한 값이 나오는 이유를 찾아보았는데 맞는것인지 궁금합니다. 실험에 사용하는 House keeping gene은 GAPDH를 사용하고 있고, 각 Sample들의 농도들이 다 달라서 농도의 여유가 있을경우에는 1000ng으로 cDNA 합성을 하고 농도가 낮은 Sample의 경우에는 10ng or 100ng으로 합성하여 사용을 하고 있습니다. Real time pcr을 실험을 할때 같은 sample로 3번 정도 돌리고 있는데 House keeping gene Ct값의 결과중에 undetermined라고 나오는데 이렇게 나오는 이유가 실험에 사용한 primer가 제가 원하는 target sample에 맞지 않아서 이러한 값들이 나오는지 궁금합니다. 그전에도 계속 사용하던 primer이기 때문에 혹시 다른 이유들이 있는지 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 전기대학원생  |  2021.07.29
Q. gram양성균 RAPD primer colony PCR 첨부파일
안녕하세요 균 동정을 위해 저수지 물을 MRS 배지에 키웠는데요, MRS배지에서 자란 균을 colony PCR하려고 합니다 MRS배지에는 lactobacillus인 그람 양성균이 자라는데 양성균을 바로 colony PCR해도 될까요? 그리고 PCR 조건은 제가 primer 1254를 사용할 것이기 때문에 primer1254를 사용한 다른 논문에서 참고하려고 하는데  그람 양성균 음성균 상관 없이 같은 조건으로 해도 되는지 궁금합니다. 벽을 깨고 해야할까요?  
회원작성글 울릉해양심층수  |  2021.07.22
Q. cell 종류에 따라 rna extraction 수율이 달라지는 이유
안녕하세요 현재 퀴아젠사의 rna mini kit으로 rna extraction 하는 중인 연구원입니다. 이번에 rna-seq 위해서 rna를 뽑고있는데 어떤 세포는 찰떡같이 rna 농도도 높고 잘 나오는데 어떤세포는 rna 값도 너무 낮고 특히 260/230 값이 0.8 ~1.5 사이로 나옵니다. 제조사의 트러블 슈팅에서는 에탄올 워시가 덜 되면 260/230 값이 낮아지고, spin colum 용량 과부화, lysis buffer 양의 과량 사용인 경우 rna 농도가 낮아진다고 되어있어서 그 내용을 반영해서 protocol을 수정했고 a,b 셀은 좋은 순도로 뽑혔습니다. 그런데 오늘 여러 종류의 세포를 같은 confluency일 때 harvest하고 rna kit extraction을 같은 타이밍에 진행했는데 a,b 셀은 여전히 잘뽑히고 나머지 c,d 셀은 rna 농도가 100이하, 260/230 값은 0.9~1.8로 나왔습니다. (260/280은 2.01~2.06) 상황이 이렇다보니 잘안나오는 셀들이 근본적인 상태가 문제인건가 싶긴한데..... cell thawing 이후에 또 신경쓸 수 있는 부분이 어떤게 있을까요?ㅠㅠ
회원작성글 rornfl  |  2021.07.20
Q. 담배에서 RNA 추출했는데 Pellet이 하얗게 남아요
저희가 담배에서 TRIzol, Chloroform, Isopropanol을 이용하여 RNA 추출을 진행하였습니다. 처음 이 방법대로 진행을 했을 때 튜브 밑에 pellet이 생겼는데 너무 하얗더라고요, 분명 물을 넣었는데도 불구하고 녹지 않았고요..  저희 박사님 중 한분께서 이건 담배에서 나오는 polysaccharide이다 라고 말씀을 하셨는데, 다른 박사님께서는 절대 아니라고 말씀하셔서 뭐가 맞는 것인지 잘 모르겠습니다.  그리고 RNA 추출 후에 nanodrop을 이용해 측정했을 때 230/260 값 또한 0.8~1.1 정도로 매우 낮았습니다.  감사합니다. 
회원작성글 MSlIFE  |  2021.07.20
Q. RNA 정량 계산식이 왜 이런지 알려주실 분...ㅠㅠ
안녕하세요. 1년차 대학원생입니다.   지금 PCR RNA추출을 하고 있는데요, 프로토콜에서 75% EtOH로 씻어주고 다 말린 뒤 15~20ul DEPC 를 넣으라고 나와있습니다. 그런데 저는 cell이 적어서 10ul를 넣습니다. 그 뒤 RNA 정량을 합니다. 저희는 spectradrop을 사용해 plate reader기에서 RNA 정량을 하는데, 계산 엑셀 파일이 따로 존재합니다. 그런데 RNA ug/ul 계산식이 260nm x 40 x 20 x 2로 되어 있습니다.  40은 RNA의 상수값, 20은 stectra drop 0.5mm cover glass여서 곱해주는데 남은 2는 희석배수인지 ... 그럼 왜 2인지 아시는 분이 계신가요? 그리고 10ul 을 넣었을 시 20ul을 넣었을 시 ug/ul 농도가 달라지는게 맞는데 계산식을 바꿔야 하는데 어떤식으로 수정해야 하는지 몰라서 여기에 여쭈어 봅니다 ㅠㅠ  
회원작성글 Crea  |  2021.07.13
Q. 조직에서 뽑은 RNA를 cDNA 만들시.
안녕하세요.  molecular를 이제 막 배우고 있는데 주변에 알려줄 사람이 없어서 일단 키워드 검색으로 여러번 찾아보았고 책도 살펴 보고 했는데 제가 정량한 값이 확신이 안 서서 맞는지 확인 하고 싶어 이렇게 글을 작성합니다. 현재 조직에서 RNA를 뽑아 논 상태입니다. RNA는 RNase-Free Water를 20㎕ 로 정량 후 측정은 nanodrop으로 하고 -80에 보관 중입니다. 이제 cDNA를 만들려고 하는데 제가 사용하려는 kit는 다윈바이오의 1st-strend cDNA Synthesis Kit입니다.  그런데 이 kit에 보면 500ng total RNA 를 이용한다고 합니다. 제가 nanodrop으로 측정한 값이.   name ng/µL A250/A280 A260/A230 total (㎕) 1 sample1 166.6 2.04 1.81 20 이렇게 나왔을 때 RNA 시료양을 측정하려고 하는데,  1. sample 1 - 500ug/166.6 = 3 ㎕       RNA Template 3㎕       Oligo 1㎕       dNTP Mix 1㎕       DEPC 8㎕  total = 13㎕ 를 만들 때 이렇게 만드는 것이 맞나요? 2. 또는 1ug을 사용 하려면  sample 1 - 1ug/0.1666 = 6㎕  으로 RNA Template 6㎕       Oligo 1㎕       dNTP Mix 1㎕       DEPC 5㎕  total = 13㎕ 를 만들 때 이렇게 만드는 것이 맞나요? 표준반응 조건 total RNA : 10ng ~ 5µg 이니 두 계산이 다 맞다면 두 계산식 조건 다 사용해도 무방한 것 같은데 맞게 계산 한 걸까요? 고수님들 ㅠ.ㅠ  맞나요? 
회원작성글 흐으으음  |  2021.07.13
Q. mRNA 백신연구에서 LDP만을 이용하는 이유가 무엇인가요?
안녕하세요 생명공학 분야로 진학을 희망하는 고2 학생입니다! mrna 백신에서 LNP가 핵심기술이라는 것과 국내에 LNP 기술이 부족해 개발이 더딘 상황이라는 알게 됐습니다. LNP가 가장 널리 쓰이는 나노전달기술이기는 하지만 크기, 균일성 및 안전성을 제어하는 데에 어려움이 있다고 알고 있습니다. 그런데도 고분자 기반 나노 입자나 하이브리드 엑소좀 등 더 효과적이라고 알려진 기술을 도입하지 않고 LNP 개발에 주목하는 이유는 무엇인가요?? (일부 회사에서 다른 전달 기술을 연구중이긴 하나 주류가 LDP인 것으로 알고 있습니다) 주변 자문을 할 사람이 없어 글 올렸습니다ㅠㅠ 감사합니다!!
회원작성글 angelashin..  |  2021.07.11
Q. soil rna prep 첨부파일
안녕하세요. 저번 글에서도 rna 추출에 대해서 여쭤봤엇는데 오늘은  다른 문제로 도움을 받고싶어서 이렇게 글을 올리게 되었습니다.    저는 논 토양에서 sampling 을 진행하고 , 바로 드라이아이스 + 에탄올로  얼려준 후에 실험실로 돌아와서 딥프리저에 보관하였습니다.  보관해둔 토양을 퀴아젠 soil kit 에 따라서 진행하였습니다.      이때 프로토콜의 10 step 후에 rna 펠렛은 명확히 잘 보입니다.  눈으로 확인이 가능할 정도요 . 그런데  그이후의 과정에서 JetStar Mini Column 에 염용액을 먼저 처리하여 컬럼을 적셔주고, 샘플을 binding 해줍니다.  그리고 다시 염용액을 넣어서 워싱해주고요. 빠져나온 용액은 버리고  필터를 새로운 튜브에 끼워서 일루션 용액을 넣어줍니다  그 뒤에 rna 침전을 위한 용액을 넣구요 . 그럼 원심분리 후에 rna 펠렛이 보여야 하는데 , 보이지 않고  농도 또한 낮게 관찰이 되어집니다.    혹시나 해서 원심분리 한 sup을 버리지 않고 e-tube에 담아 뒀엇는데  sup에서 rna 농도가 더 높게 나옵니다. 또한 JetStar Mini Column 에서 빠져나온 용액에서도 rna농도가 매우높게 관찰이 되어집니다.  (물론 둘다 purity는 좋지않아요) 확실하지 않지만 잘 모르는 저의 판단에는 step 과정에서  rna 가 온전히 다 회수가 안된것 같은데 .. 그럼 어떻게 해야할까요 ? ..  1. 원심분리전에 -30도에서 rna 침전 시키는 과정을 over night 한다.  2. JetStar Mini Column에서 10초 정도의 원심분리 과정을 거친다 . 3. 프로토콜에 따라서 ph7 짜리 phenol/chloroform/isopropanol 용액을 사용했는데,  ph4 phenol/chloroform/isopropanol 으로 바꾸어서 프로토콜을 진행한다. (실리카 컬럼인 JetStar Mini Column에서는 acidic해야 binding이 잘 된다고 하더라구요)     어떤 방법이 좋을까요 ? 부디 알려주세요 ㅠㅠ 혹여나 토양 rna 추출을 하시는 분이 있으시다면 꼭 .. 답변 부탁드리겠습니다ㅠㅠ 
회원작성글 끄덕끄덕  |  2021.07.08
Q. 코로나19 RNA추출
코로나19 PCR 하기 전 핵산추출과정에서 나오는 산물이 mRNA가 맞나요 코로나는 ssRNA로 구성되있다고 알고있는데 추출과정에서 뽑아내는게 mRNA면 바이러스가 숙주안에서 mRNA를 발현시켰기 때문에 가능한건가요?
회원작성글 당떨어진다  |  2021.07.07
Q. qPCR mRNA expression
안녕하세요 최근 primer를 짜서 qPCR 실험을 진행하게 되었는데요.. 1가지 mRNA에 대해서 10개 정도의 primer를 짜서 qPCR을 진행해 보았습니다. 그런데 이상한것이 CDS 부위로 primer를 짜서 qPCR을 한 것은 거의 변화가 없는데 CDS 앞쪽 (CDS 부위 X)으로 primer를 짜서 qPCR을 돌린것을 20배 이상 차이가 나네요.. CDS 부위가 아니면 의미가 전혀 없는 것인가요? ct 값은   CDS primer : cont (25-26), overexpression (24-25) CDS 앞부분 primer : cont(34-37), overexpression (27-31)   이것도 의미가 있는것일까요?    
회원작성글 화이팅구  |  2021.07.06
Q. phenol/chloroform/isoamyl alcohol 첨부파일
안녕하세요. 저는 total soil rna 추출을 진행하고 있습니다. 6번 프로토콜 대로 가장 위에 있는 물층을 따서 15ml tube에 넣고 , SR3용액을 1.5ml 첨가하여 진행하였는데 원심분리 후에 펠렛이 보이지 않았고 나노드롭 결과 역시 확인해 보니 rna 추출이 이루어 지지 못했습니다.  제가 첨부한 사진에서 저는 1번 층만을 따서 SR3와 믹스 후 원심분리 하였는데요.  혹시 RNA가 다른 층에 존재하고 있는거지 여쭤보고자 글을 올리게 되었습니다. 제가 이해를 잘못 하고 있는것인지 물어볼 사람이 없어 너무 혼란스럽습니다.    phenol/chloroform/isoamyl alcohol 은 PH 4 아닌, 6.5-8 사용 하였으며  지표 시약이 들어가 있어 노란색 시약입니다.    도와주세요 ..ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 
회원작성글 끄덕끄덕  |  2021.07.03
Q. Origene 제품 transfection 질문드립니다.
안녕하세요, shRNA Transfection 실험을 하고 있는데 석사 1학기생입니다. 다름이 아니고 계산에 대해 질문드리려고 합니다. 앞의 과정으로는 agar에 transformation 후 lb broth에 접종해 DNA miniprep으로 DNA를 뽑아놓았습니다. Origene제품에서는 shRNA construct일때 1ug의 농도로 opti-MEM 250ul에 dilute해 사용하라고하는데 제가 뽑은 dna의 농도가 300ng/ul이라고 가정하게되면 계산식이 300ng : 1ul = 1ug : xul로 계산하여 xul를 구한후 opti-MEM배지는 xul를 뺀 나머지를 넣으면 되는건가요? 계산에 도움 부탁드립니다.
회원작성글 냠냠긋  |  2021.07.01
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