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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Cell Biology > Cell Culture
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Q. 세포 배양 배지 오염 확인 좀 부탁드려요 첨부파일
원래 그러진 않았던 것 같은데 오늘 보니 배지에 사진과 같은 투명한? 결정체 같은 게 많이 보입니다. 결정 모양을 현미경으로 확인해보니 길쭉하게 생겼구요. 근데 그 주위에 미생물인지 동그란게 떠다니는데 이거 오염일까요?
회원작성글 초보연구  |  07.17
Q. coverslip cell culture 해보신 분들의 조언을 구합니다...
BAEC을 35π dish에 coverslip 깔고 배양해서 현미경으로 찍고 싶은데요. coverslip에 BAEC이 붙질 않아서 실험이 진행이 안되는 상황입니다. 처음에 35π+coverslip에 seeding을 하고 고대로 냅두면 coverslip 위에 부착돼서 자라긴 하나 transfection을 하거나, washing을 하는 과정에서 cell이 다 떨어져버립니다. starvation까지 해야하는 상황인데 그 전 과정에서 이미 cell들이 다 떨어져서 starvation까지는 가보지도 못했네요... 1M HCl로 coverslip을 coating하는 acid wash 방법도 해봤는데 큰 차이는 없었습니다 ㅠㅠ BAEC이나 coverslip에 잘 안붙는 cell들로 coverslip cell culture 성공하신 분 계신가요...? 조언 좀 부탁드립니다 ㅠㅠ     제가 뭐라도 좀 해보려고 시도했던거를 적어보자면 최초 seeding 후 24시간 이후에 transfection을 하였는데, transfection 후 6시간정도까지는 잘 붙어서 자라는 것을 확인 했으나 O/N로 배양하고 다음날 보니 cell들이 다 떨어져 있었습니다. -> transfection때 사용되는 PEI 때문에 cell이 damage 받아 죽는 것 같아서 transfection 8시간 후에 기존 배지는 제거하고 정상적인 성장배지로 갈아주었습니다. -> 성장배지로 갈아준 뒤에 O/N로 배양하니까 cell들이 죽은 dish도 있었지만, 일부 dish는 계속 붙어서 자랐습니다. 그래서 다음 과정으로 starvation을 주려고 성장 배지 제거하고 washing 했더니 이번엔 washing 과정에서 cell이 다 떨어졌습니다. -> 위 과정을 처음부터 다시해서 transfection 후 성장배지로 갈아주고, cell들이 좀 더 자라고 안정화(?)될 때 까지 더 오래 배양한 뒤에, 지금 washing을 전보다 더 아주 조심스럽게 했는데 이번에도 cell들이 다 떨어졌네요. 그래서 현 상황이 일단 cell 떨어진 dish를 incubator에 넣어뒀긴 한데, 이번에도 진행이 어려울 것 같습니다...
회원작성글 가우미  |  07.15
Q. cell stock 만들때 75T 플라스크 세포 양
75T플라스크 꽉 채워서 키우면 6-700만셀 정도, 스탁으로 만들면 200만셀/ml 3개 나온다고 들었는데요.   75T 최대한 빽빽하게 키운 셀에 트립신 (0.05%) 3분 치고 10FBS/DMEM 10 ml에 풀어 1000 rpm 3 min 다운시켜서 보면 펠렛 두께가 너무 얇습니다. (세포주 은행에서 받은 스톡 160만셀 펠렛의 1/3정도?) 구글에서 찾은 사진에 설명 덧붙여서 올립니다. 어떻게 하면 셀 데미지 없이 많이 가라앉힐 수 있을까요? 조언 부탁드립니다.  
회원작성글 컬쳐룸도비  |  07.15
Q. animal cell stock 액체질소 보관 궁금한게 있습니다.
제가 있는 실험실은 DMSO를 넣은 animal cell stock을 만들고나서 -80'c에서 하루정도 둔 뒤에 액체질소로 옮겨서 보관하는데요. 제가 일정 때문에 시간이 안나서 -80'c에서 약 8~9시간 정도 얼린 후에 액체질소로 옮기거나, 아니면 -80'c에 넣고 거의 2~3일 정도 후에나 액체질소로 옮길 수 있을 것 같은데요. 어느 경우가 그나마 cell에 damage가 덜 갈지 잘 모르겠습니다.. 보관시간이 딱 정해져 있는게 아니란건 알지만 제가 아직 실험 경험이 적어서 다른 분들의 조언을 구하고자 글 올립니다.  감사합니다.
회원작성글 가우미  |  07.15
Q. HepG2 cell culture morphology 첨부파일
안녕하세요, 석사후 연구원으로 한 연구소에서 실험하는 인턴연구생입니다. 현재 이곳 실험실에서 의약 케미컬 제제 세포독성(cytotoxicity) 파트를 맡고있습니다. 세포독성 실험을 위해 HepG2 cell 을 ATCC로부터 구매하여 ATCC에서 권장하는 조건대로 배양하고, 용이한 실험을 위해 배양액 적응을 위한 단계를 밟으려고 합니다. 조건은 다음과 같습니다, Medium : EMEM + 10% FBS (ATCC)  ->  DMEM(Low glucose) + 10% FBS (Hyclone) Seeding : 500,000 cells / 60mm culture plate + 5mL medium 다음과 같은 조건으로 Cell들을 적응시키기 위해서, 10:0, 9:1, ... , 1:9, 0:10 으로 계대배양 때 마다 점점 희석계수를 일정하게 바꾸어 Cell들을 적응시키고자 합니다. 여기서 문제는, HepG2 세포들이 키우기 쉽지 않고 Doubling time이 48시간이라는 것은 알지만, Proliferation 속도가 너무 느려서 적응력을 평가하기 어렵습니다.  더군다나 Cell이 부착 시 다른 Cell line에 비해 대부분 부착되지 않거나 늦게 부착이 되며, 부착된 후 Cell 외 배양액 내에 다른 부유물(부산물) 들이 떠다니는 듯한 느낌을 많이 받았습니다 현재 조건대로 배양을 진행해도 괜찮을까요?
회원작성글 박 재홍  |  07.15
Q. mycoplasma test 제발... 도와주세요.
안녕하세요. mycoplasma test 를 진행하고 있습니다. 그런데 negative 에서 자꾸 옅은 실밴드가 나옵니다. 사용하고 있는 Kit의 경우 INtron biotechnology_e-Myco plus_Mycoplasma PCR Detection Kit를 사용하고 있습니다. negative는 Kit 안에 들어가있던 DDW를 사용했습니다.  항상 sample 넣기 전에 ddw를 먼저 넣어주고, 사용하고 바로 보관을 했고 sample과의 접촉을 최대한 피했습니다. 추후 결과를 확인해보니, 얕은 밴드가 떠서 PCR 을 진행하는 ddw를 바꿔서 실험을 진행했습니다. (새로운 DDW를 사용했으며, 그때는 negative가 안나왔습니다.) 그런데, 어제 사용했던 DDW를 다시 PCR 돌리고, agarose gel에 내려서 확인을 했는데 밴드가 나오지 않아서 다행이다 라고 생각을 했습니다. 그리고, 나머지 negative sample (14ul) 을 모두 내려 확인했는데 옅은 실밴드가 또 나왔습니다... 아니 이게 어찌...어떻게... 하.... 선배님들,, 제발 도와주세요.  pipet도 에탄올로 다 닦고, 오토 돌린 tip을 D.W 넣을 때 마다 다 바꿔 끼웠고, sample은 말할 것도 없구요.... 아니면, D.W 오토 돌린 것을 조금씩 소분해놓고, 매일 다른 d.w를 사용해서 사용해볼까요...? 조언 부탁드립니다....
회원작성글 허어어어어어엉거억  |  07.14
Q. mrc-5 세포가 원래 느리게 자라나요..?
이번에 처음 세포 stock 깨워서 키우는 중인데 계대한지 5일이 지나도 아직까지 40-50%밖에 안자랍니다. ATCC에서 계대주기가 1-2주라고는 하는데 원래 이렇게 느리게 자라는 세포가 맞나요..?
회원작성글 갈몽이  |  07.14
Q. 48 well subculture 후에 cell이 거의 안 보입니다ㅠㅠ
 안녕하세요. cell culture 초보입니다.   제가 키우고 있는 cell은 돼지 Fibroblast(pEF)입니다.   100파이나 60파이에서는 subculture 후에도 cell이 잘 보였는데 48 well로 옮겨서 키우니 cell이 있는지도 잘 모르겠습니다ㅠㅠ   먼저 과정은 이렇습니다.   1. 100파이에서 키우던 cell을 DPBS washing 후 TrypLE 처리로 떼어낸 후 cell을 카운팅 하여 1*10^4으로 48 well에 300ul씩 로딩했습니다.   2. 현미경 관찰 후 cell이 80% 정도 차 보여서 subculture를 진행했습니다.(48 well 기준)    1) media suction    2) DPBS 500ul로 wash 후 suction    3) TrypLE 200ul 처리 -> 3분 incubation -> 피펫으로 cell 풀어주기    4) 15ml tube로 cell 용액(TrypLE+cell)을 옮겨 한 번 더 풀어주기    5) media 1ml를 이용해 well에 남아있는 cell 모아서 tube로 이동    6) centrifuge(1,200rpm 3min 20도)    7) pellet이 육안으로 보이지 않아 tube에 약 30ul 남기고 suction    8) media 1ml을 넣어 pellet을 풀어주기    9) 카운팅 : trypan blue 10ul + cell 용액 10ul 2반복    10) Invitrogen 기계를 이용해 카운팅 하니 A cell은 1.17*10^4/ml과 4.11*10^5으로 나오고 B cell은 1.76*10^4/ml과 9.38*10^4으로 나왔습니다.     11) 수치가 너무 차이가 나서 8)의 용액에 media 9ml을 추가하여 총 10ml로 만든 후 Luna 기계를 이용해 다시 카운팅 해 보았더니 A cell은 2.1*10^4/ml과 6.3*10^4으로 나오고 B cell은 3.6*10^5/ml과 3.8*10^4으로 나왔습니다.      12) 두 가지 기계가 차이가 커서 현미경을 이용해 눈으로 cell counting을 하려고 했으나 cell이 하나도 보이지 않았습니다.    13) cell을 너무 오랫동안 클린벤치에 두는 것 같아서 A cell은 대략 3*10^4이라 보고, B cell은 5*10^4이라 보았습니다.    14) 2*10^4과 5^10^4 두 가지로 seeding을 하려고 하니 10ml로 희석된 cell들이어서 각각 A cell은 0.7ml과 1.7ml을 로딩해야 했습니다. 그러나 1.7ml은 well에 가득차서 넘칠 정도였기에 약 800ul를 남기고 suction 했습니다. B cell은 0.4ml과 1ml 로딩했습니다.   3. 2번의 과정이 어제의 실험이었고 오늘 현미경을 확인해보니 cell이 약 10%도 되지 않아 보이며, 붙어있는 기다란 형태가 아니라 동글동글한 cell이 대부분이었습니다.   여기서 제가 궁금한 점입니다. 1. 제 subculture 과정에 어떤 문제가 있는지 선생님들의 의견이 궁금합니다. 2. cell pellet을 풀어 counting을 하기 위해 media를 넣어줄 때 양은 1ml이 적당한가요? 3. cell을 계산할 때 1 : cell 카운팅 갯수(예를들어 3*10^4) = x : seeding하고자 하는 갯수(예를들어 2*10^4)이라고 계산했는데 이 방법이 맞나요? 4. 48 well은 300ul를 로딩해주는 것이 좋고 최대 cell 갯수는 7.65*10^4이라고 알고 있습니다. 300ul를 로딩하려면 cell pellet을 풀어줄 때 media를 얼마넣고 풀어주고 카운팅 하는 게 좋을까요? 5. cell 카운팅 했을 때 숫자가 천차만별인 이유는 무엇일까요? 중간중간 cell이 가라앉을까봐 parafilm에 trypan blue 올려놓고 cell tube 섞어준 뒤 cell 올리고 다시 cell tube 섞어준 뒤 cell 올리는 식으로 했습니다. 물로 trypan blue와 cell도 다시 섞어주었구요..   100파이나 60파이에서는 문제가 없다가 48 well에서 cell도 안 보이고 제대로 로딩이 된 건지도 모르겠어서 답답합니다ㅠㅠ   무슨 문제가 있는지 자세히 말씀 좀 부탁드립니다.. 
회원작성글 notorious..  |  07.14
Q. 세포 배양 질문입니다
안녕하세요 세포주 은행에서 세포 분양 받아 cell culture를 처음 진행해 보려는 학생입니다 몇가지 질문이 있어 이렇게 여쭤봅니다 IMR-90 cell line 을 분양받았는데 배지로 MEM 을 쓰라고 되어있더라고요 근데 CO2 인큐베이터가 없어서 배지를 L-15배지를 사용하려하는데 1. MEM 배지가 아닌 L-15 배지로 IMR-90 cell culture 해도 잘 자랄까요? 2. L-15 배지를 사용하면 CO2 조절 안되고 온도만 조절되는 인큐베이터로 배양할 수 있는건가요? 3. 처음 분양 받아서 배양할 때 그냥 평범한 계대배양 방법으로 하면 되나요? 세포주 은행에서는 처음 분양 받고 할 때는 원심분리를 해서 어떻게 하라고 나와있는데 이 방법으로 해야하는건가요?  
회원작성글 dwvor  |  07.13
Q. Cell thawing 과정 중 cell 해동
Cell stock을 water bath에 담궈서 해동을 시킬 때, 얼려진 것이 하나도 없이 완전히 녹을 때 까지 워터 베이스에 놔두는 방법이 좋은가요? 또는, cell이 어느정도 해동이 되었을 때 꺼내는 게 좋을까요?  전자는 워터 베이스 안에 있는 시간이 길어지는 것 같아서 제 노파심에 어느정도 해동이 되면 vial을 에탄올로 소독하고 클린 벤치에 두면 다 녹아져 있어서 후자의 방법으로 했는데  제일 좋은 방법은 어떤 것인지 궁금합니다. 
회원작성글 카스테랑  |  07.13
Q. hPSC와 hiPSC의 차이점?!
안녕하세요 .   여러 논문을 보며 공부중인데, 궁금한게 있어서요   hPSC와 hiPSC의 차이점이 뭘까요? 논문에 보니 hPSC라고 적는곳이 있고 hiPSC라고 적는곳이 있어서요. 둘다 같은 말인건가요?   중간에 i가 induced. 유도된... 이라는 건데;;  정확하게 둘간의 차이가 먼지 모르겠네요   hiPSC culture할 때, hPSC media라고 적힌 조성대로 만든 media를 사용해도 될지 궁금합니다.
회원작성글 대학원생n  |  07.13
Q. 세포 배양할때 L-Glutamine 역할
세포 배양할때 media에 high glucose media 사용시 L-Glutamine가 세포에 어떤 역할을 하는지 궁금합니다.
회원작성글 SoliDeo  |  07.12
Q. cell coculture 시에 insert well 현미경 관찰 방법
안녕하세요.  cell 두가지를 co-culture를 하는 데에 insert transwell을 사용하려고 합니다.   다름이 아니라 insert membrane의 cell 이 잘 seeding되었는지 확인하려고 하니 현미경 상으로는 membrane만 보이고 cell 은 관찰이 전혀 되질 않습니다ㅠㅠ    다른 분들은 어떻게 membrane의 cell을 확인하시나요?
회원작성글 소취  |  07.12
Q. HeLa cell counting 하면 이상한게 보이는 데 뭘까요??
안녕하세요, 요즘 여러가지 셀을 키워서 WST-8 을 하고 있는데요... 유독 HeLa cell만 counting 하려고 떼서 트립판블루 염색을 해 보면 꼭 이렇게 지저분한 것들이 많더라구요. 같이 계대 및 seeding 한 MCF-7이나 A549, HCT116 같은 것들은 깔끔한 걸 보면 딱히 트립판블루에 문제가 있는 것 같진 않구요... 이건 sub 하기 전 HeLa cell을 찍은 사진 입니다. 약간 overgrowth 된 부분이 있긴 하지만 저런 이상한 것들이 잔뜩 보이진 않는 것 같아요. 박사님 말씀으로는 저보고 trypsin 처리하고나서 화학적으로 떼야 하는데 물리적으로 니가 팡팡 뚜드리는 바람에 cell이 찢어져서 debris가 생긴 것 같다고 하는데, 저는 트립신 처리하고 배지로 washing 해서 잘 뗐는데...? ㅠㅠ
회원작성글 전기영동  |  07.12
Q. DMSO 구매관련
업체를 통해 DMSO를 구매하려고합니다.   thermo나 sigma를 통해 구입하려고 찾아보니 가격이 생각했던것 보다 많이 비싸네요.  보통 다들 DMSO를 어디서 어느정도의 양으로 구매해서 사용하시나요?
회원작성글 대학원생n  |  07.12
Q. 2X L15 media 만들어보신분 계신가요??
 안녕하세요 선생님들  혹시 L15 media 2배로 농축해보신 경험을 가지신분이 있을까요 ??  논문에서는 그냥 파우더 형태의 L15 배지를 사용해서 2X L15 배지를 만들었다고 하는데, 직접 해보니 파우더가 다 녹지를 않더라고요.. 혹시 해당 문제를 겪으셨거나, 문제 해결 해보신분이 있으신가요 ??   
회원작성글 Anchovy  |  07.11
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