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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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Q. ELISA kit 선정
안녕하세요. ELISA MMP-1 kit를 선정하려는데 주로 사용하는 kit가 2가지 정도 있더라고요 human total MMP-1 DuoSet 과 human Pro-MMP-1 Quantikine kit가 있는데 이 둘의 차이점이 뭔지 궁금합니다. 참고로 마우스 피부 조직을 적출해 MMP-1을 측정하려고 합니다.
회원작성글 96호  |  2021.12.05
Q. IPTG induction 관련 질문입니다.
안녕하세요. low copy plasmid에서 protein 발현실험을 진행중입니다.   IPTG 처리 후에 target protein이 발현이 SDS로는 확인되지 않아서.. Western할 Ab는 없고.. RNA를 확인하기 위해 RT-PCR을 진행하였습니다. RNA양이 평소보다 IPTG를 처리하였을 때 7배..정도? 증가하였는데 low copy라도 7배 정도..? 증가하는게 맞을까요?   lacI가 같이 있는 plasmid라서 논문 protocol에 따라 1mM 농도로 처리하였고, 이전에 troubleshooting 하려고 0.5, 0.1mM 농도에서도 진행해보았었습니다. IPTG 처리를 해도 16S (CT값 8정도) 보다 낮게 target gene (16정도..) RNA양이 확인되어 문의드립니다.   replication origin은 RSF1010 입니다. broad host origin 이고, copy수는 대략 10~12 정도 되는걸로 알고있습니다.   이런 경우 IPTG를 새로 만드는게 맞을까요?;; 아니면 정상적으로 단백질은 만들어지고 있다고 보는게 맞을까요?
회원작성글 이드  |  2021.11.30
Q. GST fusion protein의 사이즈가 예상보다 작게 발현이 됩니다
안녕하세요 GST pull-down assay를 진행하기 위해 우선 GST가 tagging된 fusion protein을 purification하는 조건을 잡고 있습니다. GST vector size는 25 kDa, target protein size는 35 kDa 정도로, GST-target의 경우 60 kDa정도에 발현이 되어야 합니다. 그런데 발현을 시켜서 확인을 해보면 사이즈가 절반정도밖에 되어보이지 않습니다. GST vector도 바꿔보고 induction 시간 조건도 바꿔보았습니다 (IPTG 0.5 mM, 18도 18시간/25도 4시간). 조건을 바꾸어도 발현 정도의 차이만 있지 항상 같은 사이즈에서 밴드가 나옵니다. DNA sequencing 결과도 target DNA 중간에 종결코돈 없고, ORF도 밀리지 않는 것을 확인했습니다. (forward: BamH 1, reverse: Xho 1 enzyme 사용하였고, 주황색으로 표시된 부분이 Target DNA 부분입니다. GST vector로 cloning할 때에는 구입한 plasmid DNA를 template로 사용하여 PCR을 통해 진행하였습니다.)   현재 이 target 단백질 말고 다른 단백질도 같은 이유로 절반정도 사이즈에서 발현이 되고 있는데 sequence 상에도 문제가 없고, 조건을 바꿔도 항상 같은 사이즈에서 발현되고 있습니다.   단백질이 예상보다 작은 사이즈에서 발현되는 이유나, 어떻게 조건을 더 바꾸어 보아야 할지 조언 부탁드립니다..
회원작성글 곰토토  |  2021.11.29
Q. Human cell line에 human 유래 gene이 아닌 mouse 유래 gene을 transfection해도 괜찮은가요?
안녕하세요. 단백질 A의 기능에 대해 알기 위해 human cell line에 A 유전자를 가진 플라스미드를 transfection해서 실험을 하곤 했는데요 (western blot, real time PCR 등을 하곤 합니다), 실험에 쓰던 플라스미드의 A 유전자가 human 유래 유전자가 아닌 mouse 유래 유전자라는 것을 뒤늦게 알게 되었네요... 선배들이 예전부터 써 오던 플라스미드라서 자연스레 human 유래 유전자일 것으로 생각했는데 체크를 그 동안 하지 못한 제 잘못이겠지요... 그러면 human cell line에서 human A 단백질이 아닌 mouse A 단백질이 만들어질텐데, A 유전자가 human과 mouse에서 비슷한 기능을 한다고 알려져 있다면 이 플라스미드를 계속 실험에 사용해도 괜찮을까요? 아니면 당장 human A 유전자를 지닌 플라스미드를 구하거나 클로닝 해서 실험에 다시 사용해야 될까요? 만약 human 유래 유전자를 사용하는게 맞다면, 그 동안 이 플라스미드를 이용해서 만들었던 데이터는 사용하지 못하게 되는 걸까요?? 고견 부탁 드립니다... 감사합니다.
회원작성글 치즈파인애플  |  2021.11.28
Q. SDS-PAGE 전기영동 결과 밴드 분석과 관련해서 질문이 있습니다.
제가 이번에 생화학실험으로 SDS-PAGE 실험을 진행하였는데 이게 생소하다 보니 전기영동 밴드를 분석하는데 있어 좀 헷갈려서 질문이 있습니다. 우선 Protein ladder는 PM2510을 이용하였고 총 8개의 시료를 전기영동하였습니다. 저희가 Target gene로 EGFP 단백질을 사용하였는데 도대체 어떤 밴드가 EGFP 단밸질 밴드인지 무엇을 보고 알 수 있나요? 제가 생각하기에는 EGFP 단백질의 분자량과 BAND의 사이즈를 비교하는 것 같은데 맞나요? 또한 SUP시료를 보면 하나의 밴드가 아닌 2개의 밴드가 보이고 또 다른 시료들은 아예 밴드가 보이지 않는데 왜 이런 결과가 나왔는지 알 수 있을까요? 실험과정중 Gel을 만드는 과정에서 Gel의 시료를 넣는 부분이 조금 잘려 저희가 시료가 옆으로 샐까 봐 조금만 넣어주었는데 이것과 관련이 있을까요? 그리고 밴드를 보면 induction 전과 후의 밴드가 하나도 확인이 되지 않아서 비교를 할 수 없는데 만약 정상으로 밴드가 나왔다면 보통 무슨 차이가 있는게 정상인가요?
회원작성글 생화학22  |  2021.11.26
Q. protein IPTG induction 실험에 대해서 궁금사항이 있습니다.
protein IPTG induction 예비실험에서 shaking incubator에 세포를 배양할 때 overnight으로 진행하였습니다. 여기서 target gene는 EGFP 단백질을 이용하였습니다. 그런데 왜 시간을 overnight으로 진행하는 이유가 있을까요? 또 만약 overnight이 아닌 4시간으로만 해서 빠르게 induction을 한다면 어떠한 또 다른 결과가 나올까요? 궁금합니다. 실험의 목적은 SDS-PAGE로 전기영동을 하기 위해서 Protein induction을 진행하였습니다.
회원작성글 생화학22  |  2021.11.25
Q. 단백질 정제 관련해서 궁금한 점이 있습니다.
안녕하세요. 저는 화학과에서 석사과정중인 대학원생입니다. 실험을 하기 위해 단백질을 발현하고 정제해야 하는데, 같은 연구실에는 단백질 발현을 해 보신 분이 없어서 구글링하면서 혼자 배워나가던 중에 궁금한 점이 있어서 질문드리게 되었습니다.   제가 발현하고자 하는 단백질을 이용한 논문들의 methods를 읽어보니, 대부분의 논문에서 anion exchange chromatography와 hydrophobic interaction chromatography 이렇게 두 가지 purification 과정을 거쳐 단백질을 정제한다는 것을 확인할 수 있었습니다. 저는 단백질 정제 시 가장 흔한 방법이 His-tag을 이용해 affinity chromatography를 하는 걸로 알고 있었는데 혹시 이 논문들에 따로 표기가 되어 있지 않은건 affinity chromatography를 하지 않은 것일지, 아니면 너무 당연한 과정이어서 별도로 적어두지 않은 것인지 궁금합니다. 단백질 정제 시 His-tag을 이용한 정제를 하지 않는 경우도 있는 건가요..?   잘 아시는 선생님 있으시면 답변 해주시면 정말 감사하겠습니다!
회원작성글 새달  |  2021.11.25
Q. 단백질 정량 및 정제
His tag 단백질을 refolding하여 정제중에 있습니다. refolding에 Tris, GSH, GSSG, 0.5M L-arginine 등을 사용하고 있고 니켈컬럼을 이용하여 이미다졸을 이용하여 정제를 하는데 70%이상이 컬럼에 붙질않네요 Tris 버퍼로 정제했을때 50%정도가 침전되서 다른 버퍼로 바꿔주니 7%정도 침전으로 바껴서 버퍼를 아예 바꿨습니다 refolding에 들어있는 Tris가 맞지 않아서 컬럼에 붙질 않는 걸까요? 또한 정제후 elution을 이미다졸 빼주면 단백질이 침전되서 어쩔수 없이 찾아낸 방법으로 0.5M L-arginine을 모든 단계에 넣고 있습니다 침전방지에 L-arginine을 대체할 만한거 추천이 있다면 부탁드립니다ㅠㅠ 이미다졸이랑 arginine(0.5M에서는 살짝 노란빛을 띔)을 사용하다보니 첫 elution이 제일 진한데 이미다졸 버퍼랑 농도가 좀 다른지 -0.02mg/ml 정도 마이너스가 떠버리는 바람에 bradford를 사용하였습니다 arginine이 bradford에 반응한다고는 알고 있지만 수율 계산에는 차질이 없다가 문제는 동결건조 이후에 다시 녹여서 측정했을때 동결건조 전과 다르게 3배 이하로 떨어졌습니다 또 다른 분들은 SP 컬럼을 사용해서 endotoxin 수치가 낮은 반면에 저는 arginine을 써서 SP 컬럼을 쓰지도 못해서 arginine pI 10.76, His tag 단백질 pI 9.7(His tag 안붙었을 때 단백질의 pI 9.1)여서 pH 9.7~10.76사이의 버퍼로 Q 컬럼을 사용하면 어떨지 조언좀 구합니다ㅠ 실험실에 Thermo endotoxin removal resin이 있어 썼는데 21.5%만 되서 endotoxin 제거 제품보다는 방법으로 알고 싶습니다ㅠ Inclusion bodies washing 버퍼에 0.1% Triton X-100을 썼는데도 endotoxin 수치가 좀 높네요ㅠ 찾아보니 Triton X-114로 washing 해보라는데 X-100과 결과 많이 다를까요?   1. 70%이상이 컬럼에 붙질않는 이유 Tris 때문? 2. 침전방지에 L-arginine을 대체할 만한 것 3. 다른 단백질 정량법 추천 4. pH 9.7~10.76사이의 버퍼로 Q 컬럼을 사용조언 5. 0.1% Triton X-100를 Triton X-114로 washing하면 endotoxin 많이 떨어지는지 여부
회원작성글 찰꽈  |  2021.11.22
Q. SDS PAGE를 했는데 결과가 이상한 것 같습니다..,SDSPAGE고수님들 부탁드립니다ㅠㅠ!!
안녕하세요? SDS-PAGE 결과에서 맨 처음은 size maker이고 처음은 IPTG를 cell에 induction하여 eGFP를 포함한 plasmid를 발현시키기 전인 induction 전 상태이며 그 다음은 induction 후입니다. 그리고 그 다음은 affinity chromatography를 이용하여 eGFP를 정제하기 위한 실험을 한 wash와 elution buffer에 대한 것입니다. 제가 여쭙고 싶은 것은 induction전에 대부분의 단백질이 cell에 있으므로 대부분의 marker가 떠야한다고 예상하고 있었는데 놀랍게도 아무 것도 뜨지..않은 것 같다고 파악했습니다. 이번이 SDS PAGE처음인데 거의 어떤 밴드도 뜨지 않았다고 보는 것이 맞는 것인지..또 왜 induction전에는 없다고 뜨는데 induction후에는 있다고 뜨는지..그럼 eGFP를 제외한 나머지 밴드들도 후에서는 뜨지 않아야 하는게 맞지 않아야하는게 아닌지 싶습니다. ㅠㅠㅠ   읽어주셔서 감사합니다. 답변 주시면 정말 감사할것같습니다.
회원작성글 대학생입니당  |  2021.11.20
Q. 단백질과 EDTA 반응에 대해서
안녕하세요 실험 관련해서 질문 드립니다. 돼지 피부에서 단백질을 추출해서 보관하려고 하는데 보관용액에 PBS랑 EDTA를 사용하더라고요.    EDTA 는 킬레이팅으로 많이 사용한다고 배웠고, IP buffer 에서 EDTA의 역할은 protein이 degradation되는 것을 막는 것이고, EDTA는 2가 양이온을 제거하는 목적으로 사용된다고 알고 있습니다. 그런데 궁금한 것이 EDTA와 단백질 시료와는 반응을 전혀 안하는건지 궁금합니다. 시료를 얼마나 보관할지 모르다보니.. 보관 기간에 따라서 단백질이 손상되면 안된다고하셔서 EDTA와 단백질 시료와의 반응관련해서 질문드렸습니다. 혹여 반응을 한다면, 참고할만한 논문이 있을까요? 답변 부탁드리겠습니다.
회원작성글 리체아릴  |  2021.11.15
Q. Cibacron Blue Dye가 혈청 알부민에 결합하는 원리가 무엇인가요?
안녕하세요. 대학원 2학기차에 재학중인 대학원생입니다.  현재 저는 혈액을 가지고 혈액속 단백질을 ELISA방식을 통해 검출해내는 연구를 하고 있는데요! 보통 알부민과 같은 혈액속에 풍부하게 존재하는 단백질들을 미리 제거하여 샘플을 준비한다고 합니다. 알부민을 제거하는 방법으로  Cibacron Blue Dye를 이용한다고 하는데요, 이 염료가 도대체 무슨 원리로 알부민에 결합을 하여 샘플에서 알부민을 제거할 수 있는 건가요? 그리고 알부민제거키트가 대부분 샘플용량이 적게 사용할 수 있고, 가격대가 좀 나가더라구요!. 혹시 선생님들이 써 봤던 알부민 제거 키트중 괜찮은게 있다면 추천부탁드립니다! 
회원작성글 버들  |  2021.11.15
Q. Biuret Assay BSA 대체 관련
Biuret Assay에 사용하는 BSA를 대체하기 위해서 standard protein으로 "albumin from eggs"를 사용하려 하는데, 이를 용액으로 만들 수 있는 방법은 무엇인가요? albumin from eggs 5% 용액 만드는 법 좀 알려주시면 감사하겠습니다 ㅠ 
회원작성글 mr.oyster  |  2021.11.08
Q. 분자진단 기업에서 효소정제가 어디에 사용되는지 궁금합니다
분자진단 기업에서 효소정제 파트로 지원하고자 하는데 효소정제가 어디에 결과적으로 사용되는지 잘 모르겠습니다. 키트에 재료로 들어가는 건지? 혹은 키트 성능검사에 사용되는건지..? 정보가 없어서 이렇게 질문드립니다!
회원작성글 ehddnjs122..  |  2021.11.01
Q. 렉틴활성에 미치는 온도및 ph실험에 대해서 첨부파일
제가 논문을 읽던중에 렉틴 활성에 미치는 온도및 ph에 궁금증이 생겼습니다.  16HU의 활성을 나타내는 렉틴용을을 여러완충용액에 투석했다고하는데 이게 어떻게 %로 나타내는건지 이해가 잘이해가 가지 않습니다. 또한 HU라는 단위를 사용하는데 의미를 잘모르겠습니다.   %의 의미가 16HU까지 희석을하고 최고희석배율을 100%라고치고 최고희석배율에서 반응이 없고 16HU보다 덜희석된곳에서 반응이 있으면 75%이런식으로 애기하는 건지 잘이해가 가지않습니다. 논문을 파일첨부에 올려놨습니다.(16HU만쓴건지 아니면 16HU보다 덜희석한거까지 포함해서 이야기하는건지 이해가 안됩니다..) 혹시 이해가 가시면 애기해주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 거북이사장  |  2021.10.24
Q. His tag 단백질 침전
His tag 단백질을 정제 중에 있는데 침전이 생겨 처음보는 현상이라 교수님, 박사님 정제 버퍼를 바꿔보라는 말 이외에는 아무 조언안해주셔서 원인을 알고 싶어 글씁니다ㅠㅠ 해당 단백질은 inclusion bodies를 refolding해야하는 단백질인데 His tag가 없었을 당시에는 SP column으로 해당 단백질 이외에 다른 단백질이 많이 정제되었고 발현율도 낮아서 어쩔 수 없이 His tag를 붙이게 되었습니다. 문제는 이때부터입니다. His tag 단백질이니 니켈컬럼으로 정제를 하는데 정제되자마자 반정도가 침전이 있습니다. 하지만 침전이 있다는 것조차 모르게 elution 자체는 너무 투명합니다. 어느 컬럼으로 정제해도 elution에는 너무 투명하고 그 전단계인 refolding에서도 SDS-PAGE에서 전체적으로 반정도는 Pellet인데 해당 샘플은 너무 투명하고 TCA down에서도 침전된게 안보이네요. SDS-PAGE 내리고 나서야 확인할 수 있습니다. 그럼 Pellet을 제거해주면 되지 않냐 하시면 원심분리나 필터로 제거해도 다음날이면 또 반정도 침전되어있고 그 샘플역시 투명합니다. 해당 관련 논문 어떻게 찾아야할지 막막하고... 정제 버퍼를 바꾼다한들 침전에 안갈지 또 누가 알겠습니까... tag 때문에 침전가는 경우는 있지만 투명하면 이 또한 계속 SDS-PAGE 확인전까지 다음단계 진행못하고 His tag를 떼어낼려면 enzyme을 사야하는데 클로닝 해주신 분의 파일을 보니 thrombin으로 뗄수는 있지만 테스트 하기엔 형편이 좀 안좋네요ㅠㅠ 조언좀 구합니다ㅠㅠ refolding 방법이 잘못된건지 다른 논문 참고해서 정제 버퍼도 기존에 사용하는 방법 안쓰고 했는데도 그것조차도 elution에서 투명하나 반정도는 pellet 침전하였습니다. 침전을 제거한다 한들 dialysis 과정도 해줘야하고 동결건조 후에는 다시 녹일때 침전이 없어야하는데 계속 침전이 생겨서 결국은 단백질이 없더라구요...ㅠ 오히려 정제 못한다고 교수님이 탓하셔서 조언구합니다 원인을 알아야 thrombin을 어떻게든 사던가 뭘 할 수가 있어서 침전이 투명하게 되는 이유 조언좀 구합니다ㅠㅠ
회원작성글 찰꽈  |  2021.10.20
Q. Protein purification washing/elution
혹시 다들 purification 할 때 wahsing과 elution buffer의 양을 레진 양에 비해 어느정도 넣으시고, 몇번 반복하시는지 알 수 있을까요 ㅠㅠ
회원작성글 냥뮹  |  2021.10.17
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