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웹진 Vol.24, No.10 (2022년 10월) 발간
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein
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Q. bradford assay 원리
안녕하세요. 단백질 정량에 대해 공부를 하고 있었는데 궁금한게 생겨서 질문을 드립니다. bradford assay에 사용되는 G-250 dye에 대해서 궁금한게 생겼습니다.  G250 의 cationic form - red, neutral form - green, anionic form - blue라는데 protein과 G-250 dye의 interaction의 시작은 G-250dye에서 전자를 protein의 polarable group에 제공을 하면서 진행된다고 하더군요.  그럼 더 cation으로 되는게 아닌가 싶은가 생각이 들어서 질문을 드립니다. protein와 G-250의 결합이 van der Waals force이 가장 크게 작용하지만 ionic bond도 어느정도 영향을 주는것으로 생각되는데 protein과의 결합을 통해 free electron의 위치가 바뀌면서 G-250의 흡광도가 바뀌는것으로 유추하면 되는것인지 궁금합니다.  또한 흡광도의 변화가 dye의 conformation까지 변화를 시키는 것인지,, 도 궁금하네요 ㅠ 화학적 지식이 부족해서 질문을 드렸습니다.  감사합니다.
회원작성글 rlaeheod  |  07.30
Q. NLS와 NES를 모두 가진 단백질이 세포 외부에서도 발견 가능한가요?
안녕하세요, 이공계 관련 공부를 하는 사람은 아니고 국어 관련 일을 하는 사람이지만 도움을 구하고자 질문드려 봅니다..   올해 법학적성시험 언어이해 영역에 단백질의 합성과 수송에 관한 소재가 출제되었는데, 이와 관련한 질문입니다.   결론부터 말씀드리자면, NLS와 NES를 모두 가진 단백질(이하 ㉠)도 세포 외부에서 발견이 가능한가요?   출제된 지문의 내용에 따르면 세포 밖으로 분비되는 단백질은 소포체 위의 리보솜에서 합성된 것이어야 한답니다.   그런데 NLS는 세포질에 독립적으로 존재하는 리보솜에서 합성되어 세포핵으로 들어가는 단백질이 가지고 있는 신호 서열이라는 점으로 미루어 보아 ㉠은 세포질에 독립적으로 존재하는 리보솜에서 합성된 녀석 같은데요..   그렇다면 ㉠이 세포 외부에서 발견되는 것 자체가 불가능한 것 아닌가 하는 의문이 듭니다.   전공이 국어교육이다보니 정확하게 파악하는데 한계가 있네요.. 제 의문이 맞는지 확인 부탁드립니다 ㅠㅠ
회원작성글 국어귀신  |  07.29
Q. 잘나오던 western 결과가 자꾸만 이상하게 나옵니다ㅠㅠ 첨부파일
선생님들 안녕하세요. 이번에 쥐의 liver, SP을 이용해서 웨스턴을 계속 진행하고 있는 대학원생입니다. liver와 SP을 로딩해서 웨스턴을 진행할때마다 (계속 같은 샘플을 이용했습니다.), 잘 나오던 housekeeping gene들이 이번주 내내 웨스턴 결과에서 7/29에 나와있는 필름 사진처럼 나오지도 않고, 폰슈 염색도 자꾸 이상해서 굉장히 답답합니다..ㅠㅜ 혹시 계속 이렇게 나오는 이유는 샘플이 갑자기 잘못된 걸까요...?? 아니면 러닝버퍼들이 갑자기 이상해진걸까요...?? 필름 사진들 모두 15ug으로 로딩했었고, 샘플들은 -20도에서 계속 보관했었습니다!
회원작성글 뿡빵스  |  07.29
Q. Glucose-6-Phosphate Isomerase activity를 측정하는 방법이 있나요?
안녕하세요 클로닝을 진행중인 대학원 1기입니다. Glucose-6-Phosphate Isomerase를 codon+에 transformation 후 단백질을 발현하여 정제한 후 효소활성을 측정하려고 하는데 키트를 사라고 나올 뿐 실험 방법을 찾기가 쉽지 않네요. 혹시 활성 측정 방법을 아시는 분 계신가요? 
회원작성글 친절하게살자  |  07.29
Q. Western blot 항체
단백질 두개의 상호작용 알아보려는데 ip해서 단백질 한개는 나왔는데 다른 단백질도 찾으려고 합니다. 1차 항체로는 a-flag 쓰고 2차항체로는 a-dgk 쓰는데 순서가 잘못되었나요? Ip후 wb 하고나서의 순서 아시는분 계실까요? 초보라서 어려운데 사수는 알아서 하라고 하시니..
회원작성글 바닷가  |  07.28
Q. Human protein atlas에는 안된다고 하지만 되는 경우도 있나요?
human protein atlas가 굉장히 세계적인 database?라고 알고있습니다. 제가 원하는 부위에서 해당 단백질의 발현을 연구하고자 하였는데 human protein atlas에서 IHC하였을 때 detect가 되지 않기 때문에 RNA level에서는 발현이 되지만 protein level에서는 발현되지 않는다고 나와있습니다. 하지만 최근 교수님께 문의드리니 같은 부위의 같은 protein에 대해 IHC하여 발현된 결과를 보여주셨는데 어디서 자료를 가져오신건지 모르겠지만 human protein atlas가 틀리기도 하나요?
회원작성글 별헤는밥  |  07.28
Q. western detection 문제
어제 detection을 한 membrane을 오늘 확인차 다시 detection을 하려고 보니깐 어제보다 band가 더 희미하게 나오는데    stripping 해서 1차 ab부터 다시 해야 결과가 제대로 나올까요? 이런 경우는 처음이라 당황스럽네요 ㅜㅜ membrane은 TBST에 넣어서 냉장보관 하고 있다가 오늘 detection하려고 꺼내서 해봤는데 밴드가 어제보다 옅게 나오네요 ㅜㅜ   어제 봤을 땐 2차까지 붙여서 바로 본 결과였습니다..!! 혹여나 protein이 씻겨져 나가거나 그러진 않았을까요?
회원작성글 열두시삼십분  |  07.28
Q. western blot 실험 결과 double band로 나올 때
안녕하세요, 제목 그대로의 질문 드립니다. Western blot 실험 결과로 band를 봤을 때 double band가 뜨는 경우 어떻게 하시나요?  Protein marker와 비교했을 때 가장 정확한 위치에 뜨는 band만을 실험 데이터로 쓰시나요, 아니면 두 band 모두 데이터로 활용하시나요? 논문을 봤을 때는 후자의 경우는 못봐서 트러블슈팅을 해서 어떻게든 단일 band만을 얻어낸건지 double band에서 한 band만을 선택해서 데이터로 쓴건지 알 수 가 없는것 같아요.. 두 band 중에 한 band만이 내가 원하는 단백질이라고 한다면 1차, 2차 antibody를 붙였을 때 한 곳에만 붙는게 맞을텐데 두군데 모두에서 붙었다면 둘 다 제가 보려는 단백질이라는건지,, 아니면 쪼개져서 전기영동 된건지 (이 경우도 얼추 가능성있어보이는게 확실히 아래쪽에서 뜨는 band는 좀더 옅고 위에 뜨는 band와 굵기변화가 유사해서요),, 어떻게 생각하시나요? 의견남겨주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 experiment  |  07.28
Q. Cytosol fractionation을 western 단백질 sample 만드는 법이 궁금합니다.
안녕하세요.   western으로 오늘도 고통받는 대학원생입니다.   혼자서 실험 복기 중에 생각난게 cytosol fractionation을 이용한 western blot을 하는 분들을 논문으로 보게 되어 질문드리게 되었습니다. 성상이 pellet 같은 기타 fractionation은 ripa 나 등등 넣어 protein sample을 만들었었지만, sample로 부터 ultra를 돌리고 바로 나온 cytosol fractionation은 어떻게 단백질 sample을 만드는 지 궁금합니다.   그냥 단순히 cytosol fraction (liquid) 을 BCA 후, 농도에 맞춰 5x sample bf와 물을 넣어 western sample을 만들면 되는건지, 아니면 cytosol에 5x sample bf만 넣어줘도 되는건지 궁금합니다.      
회원작성글 kodo2001  |  07.27
Q. Protein HPLC 분석 관련하여 질문 있습니다
안녕하세요! 단백질 정제 후 HPLC 분석 과정에서 질문이 있어 글 남기게 되었습니다. 저희는 현재 정제한 protein의 purity를 확인하기 위한  목적으로 SEC를 사용하고 있습니다. 2년정도 사용했다는 Tosoh 사의 TSKgel 3000 SWXL column을 사용하다가 동일 모델을 새로 주문하여 교체 하였으며, 컬럼 교체 후 chromatogram이 기울어지는 형태로 나오는 문제가 생겼습니다.  이전과 동일하게 column 사용 전 mobile phase를  평균 1시간~2시간 정도 흘려주어 안정화 시키고 사용하였지만 초반 4~5개 sample을 분석할때까지도 chromatogram이 눈에 띄게 기울어져서 나타납니다. 새 컬럼을 사용하기 전 DW로만 wash하고 사용하였는데, 제조 과정에서 섞여들어간 불순물이 제대로 wash 되지 않았을 가능성이 있을까요? 추가적으로 column에 대한 QC 방법이  궁금합니다!   제조사에 contact 하여 질문하려고 했는데 Tosoh의 한국지사 홈페이지를 찾지 못해 bric에 질문 남겼습니다. 감사합니다!   
회원작성글 name158  |  07.26
Q. western blot 고수 분들 답변 부탁드립니다.. 첨부파일
안녕하세요. 혼자서 계속 고뇌하며 실험 중인 대학원생입니다..   mouse urine 을 사용하여 약 26 kda 정도 되는 단백질을 western blot을 활용하여 확인해보려고 하는데... 첨부한 사진(15% gel)처럼 urine 부분만 전개가 되질 않습니다. 옆에 positive control은 잘 나오구 있구요...   원래 urine 특성이 gel %와 관계 없이 running이 되질 않는건지... 아니면 제가 sample 만드는 방법이 잘못된건지... 어떻게 해야 제가 원하는 band를 안정적인 protocol로 해서 확인이 가능할 지 여쭤보고 싶습니다.   선배님들 진심으로 답변 부탁드립니다.   감사합니다. 
회원작성글 kodo2001  |  07.26
Q. His-tag / Ni-nta에서 EDTA 사용
어떤 protein의 ubiquitination을 확인하기 위한 실험을 진행중입니다. His-tagged된 ubiquitin을 transfection하고 배양 후 MG132 6시간 처리하고 lysis 하였습니다. 이후 Ni-nta 로 정제 후 western blot을 진행하는 방식입니다. 궁금한점이 제가 사용하는 lysis buffer 조성중 2mM의 EDTA가 들어가는데, chelate로 세포막을 약화시켜 lysis를 돕는다고 알고 있습니다. 그런데 EDTA가 Ni-nta 에서 ni 이온을 chelating하여 elution 시킨다고 하는데, 그렇게 되면 His-tag가 못붙을 것 같은데... 2mM의 EDTA가 정제에 큰 영향을 미칠수 있는건지 궁금합니다. 
회원작성글 Dozmal  |  07.26
Q. 세포에 단백질 처리
안녕하세요!    세포에 특정 단백질을 처리하여 western blot을 진행하고자 합니다.  논문에 의하면 cell seeding -> serum starvation -> drug treat -> protein treat 의 방법으로 진행하여야 하는데,  약물 처리 후 배지를 걷어내고 protein을 희석해놓은 배지로 교환해도 되는건가요?  아니면 약물 처리 된 배지를 걷어내지말고 protein을 바로 treat 해야되나요
회원작성글 졸려요  |  07.25
Q. protein의 upregulation을 뒷받침 해줄 수 있는 실험 방법은 어떤게 있을까요?
proteinA가 proteinB를 dose dependent하게 upregulation시키는 경우 다음으로 해볼 수 있는 실험방법이 있을까요?  time dependent, chx처리, mRNA 발현 확인 이외의 실험 방법이 있나요?
회원작성글 Dozmal  |  07.25
Q. 혹시 정상세포 중에서 PDL1과 CD47을 모두 발현하는 세포가 있나요?
  안녕하세요, 항암제 공부하고 있습니다! 제 전공이 항암쪽이 아니지만 이쪽으로 진로를 정하고 싶어서 빡세게 공부하고 있습니다. pdl1 과 cd47이 암세포에서 많이 발현된다고 알고 있는데요, 혹시 정상 세포 중에서 두가지를 모두 발현하는 경우는 없나요? 관련 논문을 찾고 있는데 검색해도 잘 나오지 않고, 논문에서 언급되지 않아서 여쭤봅니다.    
회원작성글 짱쭁  |  07.24
Q. western blot 1차 항체 관련 질문입니다!
제가 어떠한 단백질을 암호화하는 DNA 시퀀스를 vector에 cloning 하고, E. coli 에 transformation 후 IPTG 이용해서 과량 발현, 이후 His-tag과 Ni-NTA resin을 이용해서 타겟 단백질을 정제했는데요,   해당 protein이 제대로 발현되어 정제된 것인지를 확인하기 위해서, 먼저 SDS PAGE를 내려본 결과 원하는 kDa 크기로 나왔습니다.   좀 더 확실하게 확인하기 위해, western-blot 이용해서 타겟 단백질을 검출하려고 하는데요,   이 때 1차 항체를 어떻게 구해야 하나요? 즉, 제 단백질은 흔한 단백질이 아니고 제가 specific한 sequence를 cloning 해서 만든 단백질인데, 해당하는 amino acid sequence를 업체에 알려줘서 1차 항체 제조를 의뢰해야 하는건가요?   그렇다면 일반적으로 어느 업체에 의뢰를 많이 하나요?   읽어주셔서 감사드립니다!    
회원작성글 따릉릉  |  07.23
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