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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
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Q. Recombinant cytokine 처리 후 qPCR로 확인했을 때 mRNA 발현량이 차이가 나지 않는 이유가 무엇일까요?
안녕하세요, RT-qPCR 초보입니다ㅠㅠ in vitro 실험으로 cell에 직접 recombinant cytokine을 처리한 후 qPCR을 진행했는데 control과 비교해서 처리군에서 아무런 mRNA 발현 변화가 없었습니다.   recombinant cytokine 처리 시간은 다른 실험을 통해 이미 working하기에 충분한 시간임을 확인하고 진행하였습니다.   RNA 농도 및 cDNA 농도 역시 nanodrop으로 확인을 하고 진행하였는데, RNA 농도와 cDNA 농도에는 문제가 없다고 생각했었습니다. (RNA는 100 ng/uL, DNA는 1000 ng/mL 정도 였습니다. A260/A280 ratio는 RNA는 1.9, DNA는 1.8정도였습니다.)   RT-qPCR을 돌릴 땐 5X SYBR green 5uL, Primer 1 uL, DNA 1uL 씩 넣고 돌렸습니다.   혹시 이러한 경우를 경험하신 선배님들 있으실까요?ㅠㅠ   있으시다면 어떤 점이 문제였는지, 어떻게 해결하셨는지 경험에 대해 듣고싶습니다.  
회원작성글 Cinnamon  |  2020.07.16
Q. R studio 첨부파일
튜토리얼 따라서 RNAseq analysis 독학 중인 R 초보입니다. 튜토리얼에서 제공된 file을 fastq.gz file인데 아래와 같이 BAM file을 list up하라고 하더라고요. BAM file이 없으니 당연히 결과는 character(0)가 나왔어요. 제가 뭘 잘못하고 있는 걸까요.  
회원작성글 일요일  |  2020.07.16
Q. rtPCR
마우스 폐조직을 가지고 2 step rtPCR(SYBR green)을 시작하고 있는데요 1ug RNA로 cDNA 20ul를 합성하고 40ul 더 넣어 희석해서 사용하고 있습니다. PCR시 10uM primer는 각각 0.75ul, cDNA 2ul, total 10ul로 했는데 GAPDH가 22-25 cycle에 target이 37 cycle이후에 들쑥날쑥으로 뜹니다. (40 cycle안에 안뜨는 경우도 많고요) 전반적으로 늦게 뜬다는 조언이 있어서 cDNA와 primer양을 조금 늘려봤는데 그닥 큰 변화가 없습니다. RNA ratio는 문제가 없어 보이는데... 주요 문제가 뭘까요? 고수님들 도와 주세요!!    
회원작성글 어뜨케  |  2020.07.15
Q. RNA seq library 제작을 위한 RNA sample에 DNase를 반드시 처리하는 것이 좋을까요?
안녕하세요 NGS에 대해서 공부하고 있는 학생입니다. library 제작을 위해서 RNA를 trizol을 이용해서 RNA prep을 진행하려고 합니다. trizol을 이용한 prep의 마지막 단계에서 DNase를 처리하여 rDNA등을 제거하는 과정이 있는 것으로 알고 있습니다. 순수한 RNA만을 이용하여 library를 제작해야겠지만 제가 사용하는 library 제작과정중 mRNA만을 purify하는 magnet bead가 있는데 DNase를 처리해서 DNA를 제거하는 것이 반드시 필요한 과정인지 궁금합니다. 정량의 문제는 qubit을 이용하고 있기 때문에 RNA만을 specific하게 정량하면 정량에서의 문제도 없다고 판단하고 있습니다. RIN number의 경우에도 Tapestation을 이용해서 측정을 할 얘정인데, RIN number는 18S, 28S rRNA의 양의 비교를 통해서 얻는 값이기 때문에 DNA가 섞여있다고 해도 큰문제가 없지 않을까 생각하고 있습니다. 제가 진행하려는 방법에 여러가지 문제가 될만한 요소들이 보이기는 하지만 정말 문제가 될지에 대한 확신이 없어서 저와 비슷한 경험을 하신분들이 계시다면 답변 기다리겠습니다. 감사합니다!
회원작성글 무선충전기  |  2020.07.15
Q. Multiple reference genes
qPCR을 할 때 multiple reference genes을 이용할 때 엑셀에서 각 ref의 ct값을 어떻게 averaging 할 수 있는지 알고 싶고 그리고 deltadelta ct방법을 사용할 수 있나요?
회원작성글 기시우  |  2020.07.11
Q. qRT-PCR Ct 값 질문드립니당!
같은 cDNA샘플에서 돌린 결과인데도 첫번째 결과에서는 18, 두번째 결과에서는 21 이런식으로 Ct 값이 크게 차이나는 이유가 무엇일까요?? 차이나는 이유를 알아보기 위해서 96well 두개를 놓고 동시에 똑같이 처리하여 96well 하나는 running 시키고, 나머지 하나는 -20도에서 stock해놓은 다음 돌렸습니다. qRT-PCR 온도조건이나 샘플이나 다를게 하나없는데... 반복해서 돌릴때마다 GAPDH Ct 값과 Target gene Ct 값이 차이가 나는게 신기합니다. 결과적으로 Ct 값으로 계산한 Copy No.에는 차이가 없지만 ( House keeping gene, target gene 모두 동일하게 올라가거나 내려가기 때문) 자꾸 이런식으로 나오는게 이해가 잘 가지 않아서 질문 드립니다!... 단순히 저의 핸들링 문제일까요...
회원작성글 PCRCP  |  2020.07.08
Q. qPCR 결과 너무 높게 나왔습니다.
프라이머 새로 주문 후 tm 값보다 -5도 정도 낮은 온도를 anealing temp로 맞춰서 test를 하였는데요, 특정 mRNA에서 비슷한 인자보다 60배 이상 증가하는 것으로 나왔습니다. 이런경우 어떻게 trouble shoot 하나요?
회원작성글 안녕난세포야  |  2020.07.07
Q. reverse transcription 시 pcr mixture에 관한 질문입니다
이제 막 대학원들어온 초기 석사생입니다.. reverse transcription 궁금한 게 생겨 질문하게 되었습니다.. reverse transcription 시 pcr mixture로 5x reaction buffer, 25m MgCl2, 10mM dNTP, Reverse transcriptase( MMLV) 조성인걸로 알고 있습니다.. 여기서 궁금한 점은 각각의 조성의 역할과 Reverse transcriptase를 제일 마지막에 넣는 이유입니다. 아무리 검색을 하고 뒤져봐도 나오지 않습니다...ㅜㅜㅜ
회원작성글 예석  |  2020.06.27
Q. Real time PCR 시 궁금한 점
안녕하십니까, real time PCR 과정 중 궁금한 것이 있어서 질문 드립니다 House keeping gene과 보고자하는 target들을 꼭 한 plate에서 돌려야 하는지요? 델타델타 시티 값을 구하려면 한 플레이트에서 해야하는 게 맞을 것 같은데, House keeping gene과 제가 보고자 하는 Target gene이 잘 나오는 annealing temperature가 많이 달라서 따로 돌린 후 델타델타 시티 값을 계산해도 되는지 궁금합니다. 읽어주셔서 감사합니다.
회원작성글 뱌쿠  |  2020.06.14
Q. RNA seq에서 한 mRNA내의 다른 빈도수
RNA seq한 결과 같은 mRNA에서 특정 exon부위에서만 reads가 낮게나오는건 왜 그런건가요?
회원작성글 ukm97  |  2020.06.07
Q. IVT RNA 결과 해석 문의
안녕하세요! RNA 합성과 관련해서 문의를 드리고자 합니다. 저는 현재 linearized DNA로 부터 IVT kit를 이용, mRNA를 합성하고 있습니다. 합성된 mRNA를 자동화 전기영동 장치를 이용해 분석을 하면 항상 2 band 가 관찰이 되더라구요.. Total RNA가 아닌 이상 이론적으로는 1 band가 나와야되는 게 아닌가 싶은데, 평균적으로 1000nt 크기 정도가 차이가 나는  2 band가 관찰이 됩니다. 사이즈는 확연히 다르지만 혹시라도 DNA가 남아있는 건가 해서 직접 Gel 전기영동을 내려봤는데요,  아래 사진을 보시면 첫번째 gel 전기영동 결과는 RNA를 합성할 때 DNase를 처리하지 않았지만 합성된 RNA (1ug loading)에서 DNA가 관찰되지 않았습니다. 두번째 gel 전기영동 결과는 RNA를 합성할때 DNase를 처리하였고, 합성된 RNA(2ug loading)에서 DNA가 관찰되지 않았습니다.  브릭의 실험Q&A에서 관련 내용을 찾아봤을 때 2 band가 나온 이유를 유추해보자면 1) non-specific reaction 2) RNA Transcription 시 Termination이 정확하지 않음 3) Product 중 강력한 2차 구조를 갖는 product 존재 4) Heterogeneous polyadenylation 로 정리가 되는데, 1000nt 크기 차이가 나는 RNA 2개가 합성되는 건 어떤 이유와 가장 비슷하게 설명이 될까요...ㅠㅠ   마지막으로 Gel 전기영동 그림을 보시고, RNA의 상태는 괜찮은지(integrity가 괜찮은지) 의견을 주시면 감사하겠습니다.   날씨가 많이 덥네요, 이제 진짜 여름이 온 거 같습니다. 더운 날씨에 코로나도, 건강도 조심하시고 즐거운 주말 보내시길 바랍니다:)
회원작성글 콩콩이  |  2020.06.06
Q. realtime PCR 시 housekeeping gene 이 너무 들쭉날쭉합니다.
안녕하세요. realtime PCR 을 하고 있는데, house keeping gene이 샘플이 한세트라면 그래도 고르게 나와야한다고 하는데, 저는 굉장히 들쭉날쭉합니다.  샘플이 6개라면 Ct 값이 18 17 14 20 25 23 이런식으로요..(소수점 아래는 생략했습니다.) 이러는 이유가 뭘까요? 저는 trizol 을 사용해서 진행하고 있으며 step 은 다음과 같습니다. 1. harvest 시 sup 제거하고 셀 스크래퍼로 긁어준 후(0.5ml trizol/6well plate 1well) 2. Chloroform 100ul 넣고 shake 한 후 12000rpm 10min  3. 수층 딴 후 80% isopropanol(저는 120ul의 수층을 따고 있고 isopropanol 은 100ul 넣고 있습니다.) 넣고 invert 후 12000rpm 10min  4. 액체 버리고 75% EtOH-DEPC treated 로 1ml 넣고 wash 한 후 5. 액체 버리고 남은 펠렛을 DEPC water 에 녹입니다.   그 후에는 cDNA synthesis 를 키트를 이용해서 진행하고 있구요. 위 실험을 RT 에서 해도 ice 에 박고 해도 비슷합니다. 교수님이 왜 housekeeping gene 이 고르지 못하냐 하시는데..저는 무엇이 잘못인지 모르겠습니다ㅠㅠ 개선할 방법이 없을까요..? 
회원작성글 클레엉  |  2020.06.03
Q. Hybridation in situ GFP GUS
안녕하세요 답을 찾아봤지만 확실하지가 않아서 질문드려요 Hybridation in situ 는 mRNA 를 tissu상태에서 볼 수 있고 GFP 는 관심유전자와 GFP 를 fusion 한다음이 promoter가 발현되는 하에 형광물질인 GFP가 저희에게 보여지는걸로 알고있는데요 GFP도 mRNA expression pattern이라고 볼수있나요? 아니면 protein distribution인가요? GUS 는 원하는 mRNA 발현 시 beta-glucuronidase가 발현되서 파란색이 축적되는 gene reporter 로 알고있는데요 이것도 protein 인지 mRNA 인지 헷갈립니다... 그리고 GUS는 단면이 아닌 입체로 관찰 가능하고 GFP는 단면만 관찰 가능한것이 맞나요? 이 둘의 정확한 차이와 언제 사용하는지를 잘 모르겠네요 꼭 답변부탁드려요
회원작성글 summermelo..  |  2020.05.27
Q. 두 종의 공통 CDS서열 보고 Primer design 방법
안녕하세요 초보대학원생입니다. Bos tourus와 homo에 둘다 작용하는 primer를 짜고있는데 ncbi프로그램을이용하는것이 아니라 서열보고짜고있는데 잘안되서 질문드립니다.  프라이머 제작조건은 숙지하고있습니다. 교수님께서 한유전자를 정해주셨고 단백질 발현확인하기위해 primer를 짜는 것이여서 소에서 CDS, homo에서 CDS를 알아낸뒤 blast로 공통적인 부분을 찾아 primer를 작성하고있습니다. 제가 한 방법은 exon부분으로 나누어 exon이 포함되도록 짰으나 이게 아니라고합니다. 간략히 말씀해주신게 시작코돈을 체크한뒤 primer를 짜라고 하셨는데 손으로 직접해서 어떻게 만들어야 할지 모르겠습니다. 두 종의 공통적 CDS서열보고 primer 짜는 방법 조언좀 부탁드립니다. 
회원작성글 토짜  |  2020.05.26
Q. 진핵생물에서 qRT-PCR 프라이머 제작 질문
안녕하세요. 미생물전공하고 있는 대학원생입니다.   다름아니라, 진핵생물에서 qRT-PCR 프라이머를 제작하려고 하는데 지식이 부족해서 여기에 올려서 고수님들의 조언을 듣고자 합니다. 제가 알고 있는 짧은 지식은, 원핵생물은 전사된 것이 가공과정을 거치지 않고 번역으로 이루어져서, DNA 서열만으로 qRT-PCR 프라이머 제작이 가능합니다. 하지만, 진핵생물의 경우, splicing과 같은 가공과정을 거쳐 mRNA가 maturation이 된다고 알고 있습니다. 문제는, 제가 진핵생물에서 qRT-PCR 프라이머를 제작하고 싶은데, 단순히 mRNA 전사된 서열만으로 RT-PCR 프라이머를 제작이 가능한지가 궁금합니다. splicing이 여러가지 경우의 수가 있지만, 전사체 분석한 결과에서 서열을 읽은 데이터를 기반으로 제작하고자 합니다. 저의 경우, 원핵생물에서 qRT-PCR용 프라이머 제작 시, mRNA 서열의 5'부터 프라이머를 제작하였습니다만,  진핵 생물에서는 capping 된 것 보다는, poly A tail 근방에서 하려고 합니다. (위치 선정은 자유롭게 해도 되는지 궁금합니다.) 그래서,  mRNA의 3'에 가까운 150~200bp 서열을 이용하고자 합니다. 질문을 요약하면 1. 진핵생물 qRT-PCR 프라이머 제작시, mRNA 서열을 이용하여 진행하고자 합니다. -> 원래 이렇게 진행하는 것이 맞는지? 틀렸다면 어느 부분을 수정해서 다시 생각해야 하는지 궁금합니다. 2. 프라이머 제작시, 3' poly A tail 근방으로 150~200 bp 으로 진행하고자 합니다. -> 위치는 상관이 없는지 궁금합니다.
회원작성글 카제카게  |  2020.05.25
Q. miR-10a 어떻게 읽어요?
miR-10a   이걸 microRNA-10a라고 읽나요  아님 미르 -10a 읽나요..
회원작성글 깨비스콘  |  2020.05.11
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