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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > Transformation
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Q. Chromosome insertion할때 gene cluster의 장점?
안녕하세요, 실험을 설계중인 학생입니다. 제 지식이 많이 부족하여 실험분야 고수분들의 도움을 구하려 합니다.   Host(e.coli)에서 특정 substrate를 증폭하려 합니다. 그래서 substrate에 합성에 관여하는 일련의 three of synthase gene을 T5 promoter vector에 태워서 chromosome에 integration 시키려고 하는데..    논문을 찾아보니 three of synthase gene을 cluster 해서 integration 하는편이 더 좋다고 나와있는데, cluster하는 장점이 뭔지 궁금합니다.   단순히 transcriptionally active regions을 고려해서 그런건지.. 이 부분 관련해서 논문이나 자료를 찾아보다가 안되서 질문드립니다 ㅠㅠ
회원작성글 생공생공생  |  2020.11.07
Q. site mutagenesis실험 중 Dpn1처리가 되는건지 모르겠어요,,.
지금 pGFPuv로 site mutagenesis 실험을 하고있습니다,, PCR후에 Dpn1처리를 37도 1시간과 37도 O/N을 했는데 둘다 gel을 내려보면 size가  PCR후 바로 gel내린 사이즈와 같습니다...Dpn1이 template plasmid를 자르는걸로 알고 있는데,, 사이즈 변화가 없는게 맞나요,,??
회원작성글 epwkdhk  |  2020.11.05
Q. Transient expression vector는 나중에 다 분해되어 없어지나요?
안녕하세요. 지금 원형질체에 transient GFP expresson vector를 transfection시켜 실험을 하고 있습니다.   형질전환후 하루쯤 지나면 GFP 발현이 되는 것이 확인이 되는데, 세포가 분열하면서 plasmid를 나눠가지게 되고 결국에는 GFP가 거의 보이지 않는 것을 확인했습니다. 원형질체 염색체에 integration이 전혀 안되는 것 같더라고요. 그래서 지금 사용중인 GFP vector에 다른 단백질을 코딩하는 유전자를 끼워넣어서 활용해보려고 합니다. 어차피 transient expression을 위한 벡터이니 나중에 세포를 배양해서 DNA 추출해보면 GFP나 목적하는 단백질 유전자가 거의 증폭이 안될 것이라는 생각이 들어서요. 그런데 이 실험이 잘 될지 확신이 들지 않아서 보통 transient expression을 위한 vector들은 나중에 알아서 분해되고 없어지는지 아니면 일부 세포내에 잔존할 수 있는지 궁금합니다.
회원작성글 후_추  |  2020.10.23
Q. Plasmid DNA 전기영동에 관해
과학고 1학년생입니다. E. coli에서 형질전환, 미니프렙 후 전기영동을 진행한 결과인데 전기영동을 하는 이유가 올바르게 형질전환이 되었는지 확인하기 위함인가요? 또 전기영동 후 결과를 해석하는 방법을 모르겠습니다. (E. coli DH5α에 배양했고, 1레인이 마커입니다)
회원작성글 보송한리보솜  |  2020.10.15
Q. competent cell
transformation할 때 플라스미드가 circular형태가 아니고  linear 형태면 플라스미드가 세포에 들어간다해도 자라지 못한다고 들었는데 그러면 애초에 competent  cell에는 플라스미드가 없는건가요 왜 플라스미드가 linear면 자라지 못하는건가요
회원작성글 haha1234  |  2020.10.13
Q. t4 dna ligase 양 실수..
안녕하세요 transformation 실험 하는 과정 중 ligation 과정에서 2:1 로 섞은 곳에 1ul 넣어야 할 t4 ligase를 실수로 2.6ul 넣었습니다.....ㅠ 총량은 20ul이구요 혹시 문제가 되는 건가요? ㅠㅠ
회원작성글 t4  |  2020.10.09
Q. Transformation 과정에서 SOC를 넣는 이유가 무엇인가요?
Transformation 과정에서 SOC를 20ul 넣으라고 되어있는데, 실험실에 SOC를 다 써버려서 SOC가 없는 상황입니다. SOC 용액이 Transformation 과정에서 하는 역할이 무엇인가요? SOC를 넣는 과정을 생략해버리면 형질전환이 되지 않는 거겠지요...? 혹시나 SOC 없이 형질전환 하면 어떻게 되는 건가요?
회원작성글 Genome  |  2020.10.04
Q. Enzyme cut 결과 해석 도와주세요
안녕하세요 recombinant plasmid확인을 하는데 모르는 것이 있어서요 전기영동을 걸었는데 recombinant plasmid insert 부분이 너무 흐리거나 나오더라도insert 값이 550bp가 나와야하는데  recombinant plasmid insert가 700~800bp나 300~400bp  결과가 나왔는데 어디서 잘못된건지 잘 모르겠어서 질문드립니다.PCR에서 문제인가요, ligation의 문제일까요?
회원작성글 나방개  |  2020.09.18
Q. transformation efficiency를 알아보기 위한 control 그룹 설정에 관해서 질문입니다.
인서트를 넣어 라이게이션한 플라스미드를 Top10에 트렌스포메이션 해서 클로닝 하려고 계획을 세웠습니다. 거기서 제가 플레이트에 배양 후 콜로니 PCR로 인서트가 잘 들어갔는지 확인하고, 결과를 보고 미니프랩을 한다는 계획을 세우고 교수님께 컨펌 받았는데  교수님께선 콜로니PCR은 이피션시가 낮을때, 콜로니 50개에서 1~2개 나올까 말까할때 하는 방법이고,    실험을 처음 해볼때는 콜로니 PCR보다 먼저 이피션시를 알아보는게  선행되어야 한다고 하시며 인서트를 넣고 라이게이션 한 플라스미드와 컨트롤인 인서트의 양만큼 물을 넣고 라이게이션한 플라스미드를  각각 트렌스포메이션 하고 컨트롤 그룹의 이피션시를 보고 인서트가 들어간 플라스미드를 사용한 그룹의 콜로니를 몃개 선정하여  미니프랩을 하면 된다고 하십니다.    처음엔 아그렇구나 하고 실험실에 와서 잘 생각해보니  이피션시를 본다고 하는데 이부분이 잘 이해가 가지 않습니다.  어떤 이피션시를 말하시는 것인지, 컨트롤그룹의 결과를 보고 판단 한다는 것이 어떤 결과를 어떻게 받아 들여야 할지  혹시 이부분에 대해서 아신다면 설명 부탁드립니다.
회원작성글 kim.yg  |  2020.09.07
Q. DNA Transformation과 관련되서Gateway Cloning보다 자주쓰이는 최신 기술들이 있나요?
이번에 대학원생이 되어 현재 여러가지를 천천히 배우고 있는데,  배우던것 중 Gateway Cloning이란게 있었습니다. 간단하게 DNA Transformation을 할 수 있는 기술이라 편하다고 생각하고 있었는데, 오늘 Gateway cloning이 최신 기술이 아니라는 말을 들었습니다. 현재 gateway cloning 보다 더 자주 쓰이는 새로운 기술이 있는겁니까?
회원작성글 대학원생1입니다  |  2020.09.04
Q. E. coli에 GFP transformation을 시키려고 하는데
지금 실험실에서 쓰는 GFP 플라스미드가 거의 바닥나서 E. coli에 transform 시키고 추출을 하려고 하는데요. 구글링 해서 나온 사진을 보면 콜로니 만으로도 UV조명 아래서  선명한 초록빛이 나오는 것 같은데 제가 실험한 것은 그냥 허연것이 파란 불빛이 비치기만 할 뿐 초록빛이 나지 않습니다.   어두운 환경에서 UV가 방사되는 기기 주변에서 관찰했을 때 만약 transform이 제대로 이루어졌다면 콜로니가 초록빛으로 빛나는게 맞는 것이지요?   가장 기본적인 프로토콜로 여겨져 아래 내용대로 진행했습니다. 1. thawing E. coli in ice for 5 min. 2. co-incubation with DNA in ice for 30 min. 3. heat shock at 37°C for 45 sec. 4. add 1ml of SOC media 5. transfer to ice for 2 min 6. incubation at 37°C at 225rpm for 1 h. 7. take 100ul of E. coli and spread it on agar plate with antibiotic 8. overnight culture at 37°C   GFP 벡터는 pBI221-GFP이고 E. coli는 competent DH5a 50ul 사용, GFP는 28ng/ul해서 transformation 할 때 총 볼륨 100ul였습니다.   GFP 벡터에 엠피실린 저항성 유전자가 있어서  아가 플레이트에 엠피실린 100ug/ml 섞어서 만들었고요. 다음 날 보니 콜로니가 몇 개 보이는데 UV 조명 아래에서 빛이 나오질 않습니다.   왜이럴까요.. 엠피실린 농도가 적어서 많이 살아남은 것인지 아니면 특수한 기구가 있어야 볼 수 있는 것인지 잘 모르겠어요..      
회원작성글 후_추  |  2020.08.24
Q. Competent cell 만들기
Competent cell 이 않만들어져 조언 구합니다. stock cell 을 SOB에 접종후 다음날 1 L SOB.에서 OD 3.0까지 배양후 ICE 20 min, 100 mM MgCl2, CaCl2처리후 최종 80 mM CaCl2/15% glycerol 에 보관하고 안후 transformation 해보면 전혀 이루어 지지 않아 조언을 구합니다. 간편하면서 잘만드는 방법 공유 부탁드립니다.
회원작성글 kingston  |  2020.08.21
Q. Agrobacterium transformation을 위한 vector를 디자인하려고 합니다.
안녕하세요. 대학원 들어와서 처음으로  아그로박테리움을 이용한 형질전환 실험을 해보려고합니다. 저는 아미노산 8개 정도로 이루어진 간단한 펩타이드를 식물체가 합성하게 만드려고합니다. 프로모터는 CMV35S와 조직에 특이적으로 작용하는 프로모터를 이용하려고하는데요.  실험실에서 보유중인 CMV35S 프로모터를 포함한 벡터에서 불필요한 부분을 자르고 원하는 펩타이드를 합성할 수 있도록 염기서열을 끼워넣어서 첫번째 벡터를 만드려고 하고, 두번째 벡터는 동일한 벡터에서 CMV35S 프로모터를 잘라내고 원하는 프로모터+원하는 펩타이드를 합성할 염기서열을 넣으려고 합니다. 실험실에는 보통 자주 쓰이는 restriction enzyme들이 구비가 되어있고 어떤 제한효소를 쓸지는 벡터와 집어넣으려는 유전자의 염기서열에 따라 달라질텐데.. 최대한 깔끔하게 잘라서 원하는 펩타이드만 합성할 수 있게 만들고싶습니다. 여기서 궁금한 것이 생겼는데요. 제한효소에 따라서 버퍼 조성이 다를텐데 5'와 3'를 각각 다른 제한효소로 잘라도 될까요? 된다면 버퍼 조성이 비슷한 제한효소를 이용해야 할까요?   제가 이해한 것으로는 벡터 안의 프로모터와 유전자 사이에 원하지 않는 서열이 들어가는 것은 불가피하고 사용하는 제한효소의 종류에 따라 프라이머를 제작할 때 염기서열 몇개를 추가로 붙여야 한다는 것인데 바르게 이해한 것이 맞나요? 아예 쌩초보인지라 매우 간단한 팁이나 벡터를 제작할 때 유의할 점을 알려주시면 크게 도움이 될 것 같습니다.       
회원작성글 후_추  |  2020.08.14
Q. plasmid DNA mini prep 질문 있습니다
대학원 신입생입니다. 1. plasmid DNA purity (abs 260/280) 측정시 보통 1.9~2.1가 좋은 purity라고 하던데, 1.9~2.0 보다 더 높은 값(2.0~2.1미만)이 나오면 purity가 더 좋다는 의미인가요? 아니면 1.9~2.1 사이 아무값만 나오면 purity는 다 좋다고 볼 수 있는건가요?  2. Transformation을 한 competent cell을 agar에 배양시켰는데, 아무것도 자라지 않은 경우는 어떤 문제가 있는건가요? Ampicillin 농도, heat shock 처리시간 등 transformation protocol은 잘 지켰습니다. 기존의 plasmid 농도나 purity에 문제가 있어서 transformation이 아예 안됐을 가능성이 높을까요??? 3. 제 사수는 1.9~2.1이 이상적인 purity값이라고 했는데, 혹시 1.85~1.89 사이값이 나와도 큰 문제가 없나요?? 감사합니다!
회원작성글 wassupyall  |  2020.08.08
Q. All in one vector를 이용한 Cloning
안녕하세요. All in one vector를 이용해서 DH5a에 Transformation시킨 후 37도에서 overnight했는데, colony가 안떴습니다. 배지는 Amp과 kany (50ng/ul)함유된 배지를 사용했고, insert DNA는 371bp로 작았습니다.   overnight하고 대장균이 안자란걸까요? 아니면 항생제 때문에 자라지 않은걸까요 ?
회원작성글 꽃시효  |  2020.07.24
Q. pGal 플라스미드를 이용한 대장균 형질전환에서 푸른색 군체가 생기지 않는 이유
고등학교 생명과학실험 시간에 대장균 형질전환 실험을 했습니다. 유전자재조합을 하지 않은 pGal 플라스미드를 대장균에 넣는 실험이었습니다. X-gal을 넣은 LB 배지 3가지를 준비하여 1, 2번 배지는 암피실린을 포함하고, 3번 배지는 암피실린을 포함하지 않은 채로 1번 배지의 균만 형질전환을 실시했고, 그 결과 1번과 3번 배지에서 콜로니가 발견되었습니다. 형질전환은 열충격 방법을 사용했습니다.   그런데 1번 배지에서 발견돤 콜로니가 흰색이었습니다. pGal 플라스미드는 온전한 베타-갈락토시데이즈를 만들 수 있다고 알고 있는데, 저희는 유전자재조합을 하지 않은 플라스미드를 사용했기 때문에 형질전환에 성공한다면 X-gal이 분해되어 푸른색 콜로니가 생길 것으로 예상했습니다. 암피실린에서 살아남아 콜로니를 형성한 것으로 보아 형질전환에는 성공한 것 같은데, 콜로니가 푸른색을 띠지 않는 이유를 잘 모르겠습니다.   콜로니가 왜 흰색으로 떴을지 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 0225kwon  |  2020.07.18
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