이제 갓 석사입학한 학생입니다. 논문들 보면 리파버퍼로 엑소좀에서 프로틴을 추출하던데 저는 RIPA버퍼가 셀을 파괴시켜 프로틴을 얻는것으로 공부하였습니다. 그러면 엑소좀을 추출 후 RIPA버퍼를 사용하지 않고 BCA로 프로틴농도를 계산하여 웨스턴블랏을 하면 안되는것인가요?

안녕하세요. 실험 시 house keeping을 beta-actin으로 사용중입니다. 그런데 실험하는 drug이 actin 계열을 특이적으로 상향조절하는데요,  그 영향때문인지 정확하진 않지만 beta-actin이 그룹별로 경향성이 나옵니다..  ponceu s 를 사용해서 염색해보면 로딩양은 비슷해보입니다. 이럴 경우 다른 control을 사용하면 좋겠지만.. 시간이 촉박하여 다른 항체를 구입 할 시간이 없네요. 가끔 논문보면 poncue를 제시하는 경우도 본 것 같은데, 이런식으로 정량해도 될까요?

SDS-PAGE할때 그 제품을 넣어주면 젤이 안찟어지며 탄력성이 좋아지고 낮은 %의 젤에서도 밴드가 번지거나 휘어짐없이 뚜렷하게 나와서 요긴하게 썻었는데요,   저희 랩에 가끔 홍보차 오셔서 제품을 나눠주신 샘플을 쓴거였는데, 한동안 안쓰다가 요즘 필요해서 구할라고하니 당췌 어디회사 무슨제품이었는지가 기억이 안납니다... 분명 어디 서랍에 넣어놨는데 버린듯 ㅠㅠ  국내회사였던 것 같습니다. 이런 제품을 아실까요,.,.?

Western blot 을 내릴 때 마다 저런 큼지막한 bubble이 랜덤하게 여기저기 생겨서 아주 망쳐버리는데요, 뭐가 문제인지 도무지 모르겠어요.  Bubble은 동그란데 이거는 모양이 불규칙적인 걸로 봐서 bubble이 아니라는 사람도 있고 Transfer 과정에서 문제가 있는지 항상 저렇게 되네요. 혹시 같은 문제 겪었거나 해결해보신 분들의 조언을 구합니다. 저는 Nitrocellulose membrane 사용하고 있고 트랜스퍼는 100 voltage/ 1 h 차가운 상태에서 하고 있습니다. 

안녕하세요    western blot를 몇번 해보지 않은 석사생입니다.   running gel 12%의 농도로 gel을 만들었고,  APS,SDS 모두 실험전 새로 만든 후 진행하였습니다.   gel은 정상적으로 잘 만들어졌고, 전기영동을 하는데 3시간이 지나도 전기영동이 되지 않습니다.   전압은 80V/320mA 정도 되었으며, 전압상태는 기포가 생기는 것으로 보아  정상적으로 작동이 된듯합니다.   gel이 내려오지 않고 stacking gel에서 멈춘듯이 보입니다.   교수님께서는 gel의 문제라고 하는데 혹시 왜그러는지 알수있을까요? ㅜㅜ     

53BP1의 theoretical molecular weight 는 214 kDa이지만 western blot 시 observed molecular weight 가 ~250 kDa 로 나옵니다. 처음 의심했던 부분은 아미노산마다 분자량 차이가 있기 때문에 무거운 아미노산이 많이 포함되어 있어서 그런가 싶었는데, 아미노산 서열을 받아서 계산기에 돌려보니 214kDa이 나왔습니다. 다음으로 post translational modifications, post translation cleavages, relative charges등이 있을 것이라 생각은 해봤지만, PTM과 같은 과정으로 theoretical molecular weight 와 observed molecular weight 사이에 35kDa이 넘어갈 정도의 차이가 날 수 있는지 궁금합니다. 아니면 다른 이유가 있는걸까요? ㅠㅠ

안녕하세요  지금 웨스턴을 디자인하고 있는데 기초적인것이 헷갈려서 질문드립니다.  편의상 우측방향으로 진행된다고 쳤을 때  promoter-A-HA-terminator, promoter-HA-A-terminator (A는 임의 단백질) 이 경우에서 1. HA로 IB를 하면 전자는 HA크기로, 후자는 A + HA 크기로 봐야되는지와 2. 1에서 만약 HA+A의 크기로 봐야된다면 A에 specific한 antibody로 IB 진행 시 A 사이즈로 봐야되는지 A+HA 사이즈로 봐야되는지  정말 기본적인 질문인데 너무 헷갈려서요 설명 부탁드립니다

안녕하세요  웨스턴블랏 할 때  단백질 정량 후  제가 원하는 loading양 설정 한 다음에  그 loading양에서 loading sample buffer를 설정하고  남은 양을 dw로 맞춰서 loading하는것으로 알고 있습니다. 예를 들어  원하는 단백질 농도가 20이고  a b c d 군 od값에 따른 농도 20일 때  각 4.14, 4.51, 4.5, 4.31 이럴 때  5x lsb이고 loading양을 9로 하고 싶으면  lsb는 1.8 넣고 각 샘플 4. 몇 넣고  나머지를 dw로 용량 9 맞춰주는것이 맞나요?   꼭 dw를 넣어줘야 하나요?  

BSA (2mg/ml)로 정량을 하고 있습니다.  X축을 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 (ug/ul)로 설정하여 standard curve를 그릴려고 하는데  각각 BSA (2mg/ml)에서 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ul 씩 취하면 되는게 맞는지 확인하고 싶습니다. 

안녕하세요 wesetrn blot 사진보시면 특정 antibody(Smad7)사용했을때 ladder가 저렇게 됬는데 왜 저런 현상이 일어나는지 궁금합니다.   그리고 또 band가 왜 토끼 귀모양처럼 양쪽 사이드가 끌려내려오는 형상을 하고있는지 궁금합니다!!

Sample loading 하기 전에 gel을 넣고 buffer를 채우려는데 10X buffer가 굳은게 너무 안녹는 바람에 시간이 생각보다 많이 지체됐습니다. 아직 sample은 gel에 loading 안한 상태이고 gel은 이미 카세트에 꽂고 주위에 buffer를 채워둔 상태인데, 이 상태에서 카세트 뚜껑을 닫은 상태로 4도에서 gel을 놔두면 많이 안좋을까요..가능하면 아침에 나와서 gel을 내릴까 싶어서요.

안녕하세요, Western blot 실험시 평소 12% gel 프로토콜만 사용하다가 15% gel을 만들어보려고 합니다. 기존 조성표에서 어떻게 수정하면 되는지 도와주시면 감사하겠습니다ㅠㅠ   <sep> 1.5M Tris(ph8.8): 5ml 30% acrylamide: 8ml 10%SDS: 200ul DW: 6.6ml 10% APS: 200ul TEMED: 8-12ul   <stack> 1.0M Tris(ph6.8): 1.25ml 30% acrylamide: 1.7ml 10% SDS: 100ul DW: 6.8ml 10% APS: 100ul TEMED: 10ul

안녕하세요 제가 western을 배울때 western 단백질 추출 과정 중 BSA를 통해 STD curve를 그리고 그걸보고 protein, RIPA1x, Sample buffer 5x 하여 sample을 만들었는데  지금 RIPA1x는 없고 RIPA10x는 있습니다.  이때 10x의 RIPA를 1xRIPA로 만들려고 하면 DDW로 9:1 희석후 voltexing하여 배운대로 진행하면 되나요?   희석할때 DDW로 희석하는게 맞는지 궁금합니다. 

Exosome 을 보려고 CD81, tsg101 에대한 항체를 사용했습니다. 그런데 웨스턴 결과에서 알부민이 보일 수 있나요? 저는 엑소좀에 특이적인 항체를 이용했는데 어떻게 알부민이 타겟팅이 될 수 있죠? 70kda주변에 형성된 진한 벤드 (터진듯한 벤드) 가 알부민인거 같아서요..

그리고 band lane이 휘는 것은 comb를 잘 못 뽑거나 transfer 시킬 때 겔 위치를 잘 못 잡으면 첨부한 결과 처럼 나오나요? 그리고 첨부한 결과에 어두운 얼룩? 같은 것이 많은 것 같은데 이유가 있을까요??

세포 키운 후 media 회수해서 UF로 농축 후(100배), UF로 desalting&buffer change(pbs)한 후 western 결과 입니다. 75~50kda사이에 벤드가 터질 듯한 모양이 보입니다. 타겟 단백질이 아닌데…. media의 어떤 단백질이 농축되어 나타난 것 같습니다. 어떻게 저 단백질만 선택적으로 제거할 수 없을까요? 아니면 애초에 저런 단백질이 없는 fbs, media 추천해주실 것이 있으신가요? 감사합니다..!