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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Cell Biology > Transfection
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Q. KD cell line을 만들때 shRNA가 targeting하는게 CDS,UTR인지에따라 큰 차이가 있나요?
안녕하세요 실험 관련 궁금한 점이 생겨서 도움을 받고자 글을 남겨봅니다.   어떤 유전자A에 대해서 각각 CDS부분과 UTR부분을 targeting하는 shRNA가 있을때 보통 어떤 것을 더 많이 사용하나요? 아니면 KD cell line을 두 종류로 다 만드시나요? rescue실험을 할때 3'UTR KD line을 사용하는 이유도 잘 모르겠네요ㅠㅜ
회원작성글 만긔  |  2019.11.09
Q. 293세포에 마우스 유전자 삽입.. 발현여부
293 세포에 마우스의 특정 단백질 유전자를 넣은 세포를 받았는데요. 실험이 잘 안되서어서 해당 단백질이 잘 나오는지 컨펌하고 가려는데   실질적으로 잘 안나와서요.  저희가 실험을 잘못하고 있는 것인지 세포에서 유전자 발현 자체가 잘 안되는 것인지. 확인이 불가하네요.   일반적으로 293에서 마우스 단백질이 잘 발현이 될는지 궁금하네요. Transfection 쪽으로는 잘 몰라서 여쭤봅니다.
회원작성글 비타민B  |  2019.11.08
Q. Stable cell line제작시 protein 발현 질문
안녕하세요 졸업할 때 까지 stable cell하곤 관련 없을 줄 알았는데 어쩌다 만들어야 하는 석사생입니다. DNA vector를 transfection해 stable cell line을 만들게 되었는데요. 제가 제작한 construct는 transfection하고 24시간 째 강하나 48시간 째 급격히 떨어지는 특징을 가지고 있습니다. 발현이 지속되지않는 특징을 가지는데 stable을 위해 거진 한달가까이 키우는데 protein 발현이 제대로 될까 싶어서 질문해요. Protocol이 있는거 보면 그러지 않으니까 있지싶지만 궁금합니다~
회원작성글 에효효  |  2019.10.10
Q. Bacteria는 유전자 knock out 시킬때 무슨방법을 쓰나요?
보통 박테리아의 gene의 역할을 알아보기 위해서 그 gene을 plasmid vector에 주입해서 E.coli에 넣어 확인하는게 주인데 저는 이 박테리아 자체에서 유전자 하나를 knock out 시키고 싶은데 CRISPR은 박테리아에 적용하는 예시도 거의 없을뿐더러 그쪽으로 적용하는 서비스는 지원하지 않는다고 하더군요. 제가 결과를 좀 빨리 내야해서 기업에 맡겨야 되는 상황이라서 그렇습니다만 박테리아를 knock out시키는 기법에는 보통 무엇이 있으며 그 기법으로 knock out 된 균주를 만들어주는 업체가 있다면 소개부탁드립니다.
회원작성글 ㅁㅁㅈㅈ  |  2019.10.04
Q. Jurkat transfection 실험
안녕하세요. 현재 transfection을 처음 시도하고 있는 학생입니다. jurkat cell 및 T사의 jurkat cell 용 transfection reagent를 이용하여 transfection 진행하고 있습니다. plasmid DAN 2.5 ug씩 넣어주고 transfection reagnet와 충분히 섞어준 후 jurkat cell (750000cells/well, 6 well plate)에 drop-wise로 떨어뜨려주었습니다. 그리고 현재 24시간 정도 incubation 진행하였는데 지금 보니 jurkat cell들이 거의 다 바닥에 붙어있더라구요.... 혹시 jurkat cell을 이용하여 transfection 해보신 분들 이런 경우가 있나요..?? 아니면 제가 transfection하는 과정에서 무언가 실수한 것이 있을까요...   그리고 또 한가지 질문은 jurkat cell line의 경우 suspension cell인데 selection 시에 어떤 식으로 하시는지 알려주실 고수님 계신가요!! 제가 조사한 바로는 soft agar colony formation assay를 약간 변형시켜 0.3% agarose (final con.)를 이용하여 colony의 형성을 확인하더라요.. 혹시 이 방법이 맞는지, 아니면 사용하시는 다른 방법들이 있는지 알려주시면 매우매우매우 감사하겠습니다!!!
회원작성글 ㅎㅅㅎ;;  |  2019.10.01
Q. Lipofectamine 3000 protocol 문의
Lipofectamine 3000을 이용한 Transfection 실험도중 protocol을 보고 Opti-MEM 250 Lipofectamine 3000 3.75 DNA 2.5 P3000 5 한번에 넣어서 incubate를 해도 상관이 없는지 굳이 나눠서 해야하는 이유가있는건가요?
회원작성글 떡볶이3  |  2019.09.29
Q. empty vector as NC
논문(방법) 중 일부 문구인데요..(정말 기본적인 내용인데, 처음 접해서 여쭙게 되었어요..ㅠ) "plasmids pcDNA3.1/CCAT1(pcDNA3.1/empty vector as NC) and shCCAT1(shRNA as control) were synthesized~~" 에서 NC의 의미와 각각 요소는 무엇을 하는데 이용해주실 수 있을까요?ㅜ
회원작성글 심바닐라  |  2019.09.25
Q. PEI transfection 이후 media change
HEK293T에 PEI를 이용하여 Transfection을 하는 실험을 진행하고 있는데, Transfection 3시간 이후에 plain DMEM으로 갈아주고18시간 이후에 항생제가 들어있지 않은 10% FBS DMEM로 media change를 해주고 있는데 Transfection이 잘 되지 않는 이유가 혹시 media change 시간의 영향이 있을까 해서 질문 드립니다.  
회원작성글 제ㅔ  |  2019.09.14
Q. NSC knockdown 실험중
NSC를 plate에 붙이기 위해 protocol 대로 35mm dish에 Poly-L-Lysine ,PLO,Laminine,FN 을 넣고 클린 벤치 자외선에 overnight 시켰습니다. 그런데 사정이생겨 내일부터 다음주 월요일까지 실험실에 못나오게 될거같은데 혹시 클린벤치안에서 얼마나 보관이 가능하며 혹 보관이 안된다면 -4 도 냉장고에 그대로 보관이 가능할까요?   사실 다시만들면 되긴하는데 PLL이 여분이없어서 그렇습니다 ㅠㅠ.. 감사합니다.
회원작성글 틉..  |  2019.09.13
Q. 잎사귀내 포도당(단당류) 농도변화를 알 수 있는 실험이나 장치가 있을까요?
안녕하세요? 광합성에 따라 잎사귀내 포도당(단당류) 농도변화를 알 수 있는 실험이나 장치가 있을까요? 정량적인 변화보다는 변화가 있다 없다의 유의미한 의미로 확인할 정도로 생각하고 있습니다.
회원작성글 화니쌤  |  2019.08.18
Q. 293T cell
안녕하세요 293t cell에 대해서 찾아보던중 궁금한게 생겨 질문올립니다 293 t cell이 transfection 효율이 높다는것이 Transfection된 유전자의 발현을 높일수 있다 라는 의미인가요 아니면 transfection자체가 잘 된다는 의미 인가요 고수님들 도와주시면 정말 감사하겠습니다
회원작성글 fall3502  |  2019.07.20
Q. Transfection시 사용하는 media
이제 막 실험을 배우기 시작한 학부생인데요, HEK293 cell과 HCT116cell에 DNA transfection할때 transfection용이 아닌 계대시 사용하는 배지로 10%FBS와 1x antibody가 있는 DMEM배지와 RPMI 배지를 사용했는데 이렇게되면 transfection이 아얘 안되나요...?ㅠ
회원작성글 아련  |  2019.07.18
Q. cell contam
cell이 컨탐됐는데 빅테리아 없애는 방밥없을까요...??ㅠㅜㅠㅠ 한두번이아니라서ㅜㅠ transfection 되는 애여가지고ㅠㅜㅠ
회원작성글 kikiki12  |  2019.07.15
Q. 세포 배양 견학
안녕하세요 동물 혹은 곤충 세포 배양에 대해서 한번만 견학 가능한 곳 있을까요?   단백질 정제를 위해서 setting 해서 실험을 하려고 하는데 혼자 자료보고 하려니 영 감이 안잡히네요.   대전이지만 어느지역이든 도움주신다면 찾아가겠습니다   개인적인 사례는 드리겠습니다. (연구비 아닌 순수 개인돈)
회원작성글 코난20  |  2019.06.20
Q. Transfection 실험에 대한 결과에 대해 궁금합니다.
우선 GFP sec61, GFP Tom20을 이용한 대장균 플라스미드 DNA를 형질전환, mini prep해서 미리 배양해 둔 MEF cell에 transfection하여 소포체와 미토콘드리아를 관찰하는 실험을 하였는데요. Sec61 MEF cell에서는 소포체는 잘 관찰되었지만, Tom20 MEF cell에서는 미토콘드리아는 세포 전체가 녹색형광 발현되어 미토콘드리아만을 관찰할 수 없었습니다. 실험은 동시간에 같이 진행하였는데, 미토콘드리아 관찰을 위한 MEF는 의도대로 진행되지 않아 이렇게 질문하게 되었습니다. 어떠한 이유때문에 이러한 현상이 발생했는지 알 수 있을까요?
회원작성글 Hella  |  2019.06.09
Q. luciferase assay 질문드립니다
dual luciferase assay를 하고 있는 학생입니다. 제품은 promega의 nano glo 제품을 사용하고 있습니다. nano-luc DNA가 Renilla 대신으로 사용되는데 nano 값이 firefly값이 뛰는 것과 같은 현상이 나타납니다. firefly이 값만 본다면 값의 차이가 많이 나는데 Nano와 함께 볼시 값의 차이가 나지않습니다. Nano가 normalize하는 control로 사용되는데 값이 변하는게 맞는 것일까요 ㅠㅠ 이런 경우에는 어떻게 해야 좋을까요 ㅠㅠ
회원작성글 chWk  |  2019.05.26
Q. CHO cell & N2a cell transfection ... ㅠㅠ
안녕하세요. 실험실에서 HEK293T cell을 주로 이용ㅎㅐ서 실험하다가 최근에 실험조건때문에 CHO cell이나 혹은 N2a cell로 세포를 바꾸서 실험을 진행을 하려고 합니다. 하지만 transfection부터 막혀가지고 실험 진행이 전혀 되지 않고 있는 상황이네요 ㅠㅠ CHO cell은 transfection이 잘 된다고 알고 있긴한데.... 제가 보려고 하는 단백질에 GFP가 tagging되어 있습니다. 그치만 transfection을 해서 형광 현미경으로 확인을 하면 GFP가 전혀 보이질 않네요 ㅠㅠ.   혹시 CHO cell이나 N2a cell에서 transfection하시는 분 있으시면 조건이나 방법을 좀 알려주실수 있을까요 ?   아! 저희 실험실에서는 lipofectamine 2000을 이용해서 transfection을 진행하고 있습니다.
회원작성글 헐쿠  |  2019.05.14
Q. Lentivirus production 시 293FT cell 상태
현재 Lentivirus를 만들고 있는데요. 한번 만들어서 항생제로 확인했고, western으로도 KO가 된 것을 확인해서 바이러스가 정상적으로 만들어진 것을 확인하였습니다. 그리고 다시 바이러스를 만들기 위해 protocol대로 packaging plasmid를 넣어주고, 8시간 뒤 fresh media로 change 해주었는데요. 약 2시간만에 아래처럼 cell들이 뭉텅이로 plate에서 떨어져 나가 말리는 현상이 나타납니다. 제 생각에는 cell이 100%로 꽉 차 있었고 plasmid를 넣어주게 되면 293FT cell들이 부풀어 오르는 현상이 일어나면서 cell들이 떨어지지 않았나 싶은데요. plasmid를 넣어주기 전에는 떨어진 cell이 없었고, media를 change 하면서 부터 cell이 떨어집니다. change 하자마자 떨어지지는 않았구요. 혹시 아래처럼 저와 같은 현상을 겪어보신 분이거나 혹은 다른 분들의 조언을 구하고자합니다.     
회원작성글 삼삼오오  |  2019.05.13
Q. 특정 유전자를 CRISPR/CAS9 knockout 시 에도 protein (단백질) 이 발현 하는 원인은 무었인가요?
안녕하세요. 모 대학교에서 석사진행중인 학생입니다.   human embryonic stem cell에서 특정 유전자를 CRISPR/CAS9으로 knockout 실험을 진행 중에 있습니다. genomic DNA를 통해 PCR, T7E1, sequencing 으로 knockout을 확인 하였고 qPCR을 통해 감소된 발현도 확인하였습니다.   문제는 western blot을 통해 protein 발현을 유무를 확인 과정에 wild type의 같은 cell을 control로 잡고 실시 하였는데 control과 차이 없이 똑같이 단백질을 발현하고 있습니다. 원인을 찾지 못하여서 질문드립니다.   gRNA는 exon과 intron 사이에 걸쳐서 디자인 되었구요 sequencing 결과에서 4개의 deletion 을 확인하였습니다.   knockout을 sequencing을 통해 확인 하였는데도 단백질 발현의 차이는 없을 수 가 있는건가요?? 이러한 현상이 나타나는 원인들은 무엇이 있을까요??   alternative splicing으로 인해 타겟한 gRNA가 잘못 된걸까요?   짧은 지식으로 원인을 찾기 어려워 답변부탁드립니다.
회원작성글 도움  |  2019.05.02
Q. LNCaP transfection이 어느 순간 부터 안돼요..
제발 도와주세요.. 질문그대로 LNCaP cell transfection이 어느 순간 부터 안됩니다. 총 5가지 prostate cancer cell line에 동시에 siRNA 를 처리하면 DU145나 PC3는 이펙트가 굉장히 좋은데, 같은날 같은 손으로 실험했음에도 불구하고 LNCaP은 트렌스펙션 효율이 굉장히 떨어지고, C4-2, C4-2B cell line에서는 낙다운 이펙트가 DU나 PC3 보다는 좋지 않습니다. 어느 순간부터 낙다운이 안돼서 siRNA의 문제일 것이라 생각했는데, 다른 분들은 낙다운이 잘 된다고 합니다.(cancer stem cell-glioblastoma) 현재 siRNA에 RNAimax를 사용하고 있고 6well 기준 siRNA 2ul, RNAimax 4ul처리 하고 있습니다. (20nM) LNCaP cell이 굉장히 예민한 쎌이어서 메인테이닝하는동안 문제가 생겼을 것이라 생각하여 유사한 실험을 하고 계시는 포닥박사님께 쎌을 받아서 실험을 해도 낙다운이 안됩니다. 그 이후에 포닥박사님께서 계속해서 maintaining 하던 쎌(이전에 제가 받아서 낙다운이 되지 않았던 쎌과 동일) 에 동일 쎌넘버로 씨딩한후 트렌스 펙션을 하셨는데 낙다운이 잘 되는 것을 확인하였습니다. 여러번 쎌 상태에 문제가 있어 낙다운이 잘 되지 않는 것이라 생각했는데 새로운 쎌 스탁을 풀어도 낙다운이 잘 되지 않습니다. 제가 트렌스펙션 과정중에 무언가를 잘못하고 있는 것인지, 저의 손이 정말 문제인것인지 고민이 많습니다. 제발 도와주세요..!
회원작성글 나무나무  |  2019.04.25
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