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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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Q. 웨스턴블롯 저분자 단백질이 transfer 되지 않는것 같습니다 첨부파일
멤브레인 폰슈 염색을 진행하면 사이즈가 큰 부분은 잘 넘어가는데, 사진에 네모 친 곳처럼 저분자 부분은 하얗게 빈것처럼 나와 있는걸 확인할 수 있습니다. 버퍼문제인가 해서 sonication 으로 혼합해 보고, transfer 시 위치 문제인가 싶어 멤브레인을 위아래 뒤집어서 해봐도, 저부분만 저렇게 보입니다. 사이즈가 작아서 멤브레인 뒤로 다 넘어가버렸나 싶어서 전압과 시간을 낮춰도 같은 현상이 나옵니다. 실제로 항체를 붙여도 베타아밀로이드 같이 작은 단백질은 검출이 안되고요. 저같은 경험 하신 분 있으신가요, 어떻게 해결해야 할까요
회원작성글 AGCT  |  04.29
Q. sds-page 전기영동 실험 첨부파일
사진은 빵밀 4개 품종(A, B, C, D)에서 분리된 단백질의 글루테닌 단백질 분획을 SDS-PAGE 전기영동으로 전개시킨 겔의 고분자량 폴리펩티드 부분만을 나타낸 것인데, 품종 특이적인 폴리펩티드는 무엇이고, 고분자량 폴리펩티드의 종류가 품종마다 다른 이유는 무엇인지 궁금합니다.
회원작성글 quiokie  |  04.29
Q. sds page 내릴때 dye+sample의 band가 너무 넓게 나타납니다.
안녕하세요. 단백질 실험 쪽은 아직 초보인 석사 대학원생입니다. 저는 현재 3.4K Da의 단백질을 sds-page를 통해 확인하고자 하는데 MALDI-TOF로는 확인이 된 샘플인데 전기영동을 내려보면 위의 사진과 같이 전기영동 내려갈 때 차츰 벌어지더니 끝날 땐 많이 벌어졌습니다.  전기영동 조건은 2X sample buffer와 단백질 sample을 1:1로 섞은 것을 well당 10ul씩 넣어주었고 15% gel에 200V로 내렸습니다. 1. 밴드가 휘어지게 뜬 건 뭔가 gel을 tank에 끼울 때 버퍼가 조금씩 새는데 그걸 제가 캐치를 못한 것 같습니다만... 저렇게 loading dye가 벌어지는 건 왜일까요 ㅠ 2. ladder maker 또한 밑에 내려갈수록 희미하게 뜨던데, 혹시 ladder marker에서 크기가 작은 marker band가 좀 진하게 나오게 하는 팁이 있다면 한 수 가르쳐주시면 감사하겠습니다,,,
회원작성글 와디와디  |  04.27
Q. Western blot troubleshooting 부탁드립니다! 첨부파일
  안녕하세요 이제 갓 입학한 대학원 신입생입니다.   몇달 째 WB을 하고 있는 중인데, 유독 한 antibody에 대한 결과가 잘 나오지 않아 질문 드립니다.   우선 sample은 mouse tissue에서 얻어낸 sample입니다. well 당 20 ul 씩 loading 하고 있고, protein의 양은 12ug으로 동일하게 넣습니다. 1st antibody는 fibronectin (abcam, ab2413)이며 titer는 1:250 으로 사용하고 있습니다.   제가 하고 있는 실험 과정을 쭉 설명드리자면   gel : 1.5mm, 15 well 사용/8% acrylamide gel western blotting loading (Bio-rad) : 60V로 1시간 반~2시간 + 120V로 1시간 transfer (Bio-rad) : 60-80 V, 200-250 mA, 3시간 ~ 3시간 반 blocking : Bio-radd의 every blocking 사용, RT 10분 1st Ab : cold room, 15시간 2nd Ab : RT 1시간 (anti-rabbit으로, titer는 1:5000 사용중입니다) detector : ABfrontier 사의 detector 사용     Wash는 TBST로 5분 씩 3번 해주며, 10분씩 3번 해줄 때도 있습니다.   제가 가장 많이 바꾸는 조건은 transfer 과정인데요, cold room에서 O/N 하면 좋은 결과를 얻는다고도 해서 그렇게도 해 보았는데 Fibronectin은 결과가 잘 안 나옵니다.   또한 어떤 날에는 60 V에서 200-250 mA가 되고 어떤 날에는 80 V에서 200-250 mA가 되어서 최대한 A을 일정하게 맞추려고 voltage 값은 바꾸어 줍니다 (보통 60-80V 사이). 대부분 100 V로도 많이들 사용하시길래 시도해봤는데, gel이 녹고 membrane이 말라버려서 결과가 안 예쁘게 나오더라구요...   우선 경향성 자체는 제가 생각한 대로 1-4번, 7, 8번 lane이 비슷하게 연하고 5, 6번 lane이 진한 것은 맞는데 크기가 245 kDa라 그래서 잘 안 넘어오는건지 자꾸 결과가 안 좋습니다ㅜㅜ 저걸 band라고 봐야할지도 모르겠구요....   2 band인 것은 항상 2 band로 떠서 둘 다 가져가긴 하는데 대체 왜 저렇게 background도 심하고 진한 부분은 번짐이 심한지도 모르겠습니다.   선배님들의 고견을 여쭙고 싶습니다. 감사합니다.
회원작성글 도로도로도로록  |  04.26
Q. 재조합단백질kdal단위 계산하는법
대략8kb 정도되는 재조합 플라스미드벡터인데요  sds-page에 ladder넣고 몇kilo dalton인지 어떻게 계산해야하나요? 인터넷으로 확인해보니 아미노산 평균 분자량110으로 하고 코돈이3으로 나눠야한다는데  재조합 단백질시 몇kdalton인지 계산하는법 부탁드리겠습니다 선배님들 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 
회원작성글 choheec  |  04.25
Q. western blot CD63, HSP70 질문있습니다
exosome characterization을 위해 CD63, HSP70을 이용해서 western blot을 진행하는 중입니다. 저 항체들로 western blot을 진행하면 이상하게 b-actin자리에서 밴드가 나오고 CD63, HSP70 위치에서는 밴드가 나오질 않습니다. 혹시 원인이 어떻게 될까요.. 찾아도 나오지를 않아서 이렇게 질문드립니다 ㅠㅠ
회원작성글 태태태  |  04.23
Q. mmp-1 양상이 뒤집힙니다
UV 처리 후 mmp-1의 양상을 보기위해 웨스턴 블랏을 진행중인데요, UV- 그룹과 UV+에서 mmp1 양상이 각각 반대로 나옵니다. uv- 그룹이 과발현 되고, 오히려 uv를 처리하면 감소합니다. 다른 셀을 키워도 봤고, 단백질을 다시 뽑아도 봤습니다. 그리고 베타엑틴 확인시 정량에는 문제가 없었습니다. 다만 passage가 30 언저리인데 이러한 경우 mmp 양상에 영향을 미칠수가 있을까요?
회원작성글 졸업시켜줘요  |  04.23
Q. Western blot 을 중간에 멈추는 방법 ?
Western blot을 하려고 하는데  금요일날 running 및 transfer를 하고 TBS-T용액에 membrane을 주말 이틀 간 담궈 놓은 다음  월요일에 1차 항체 붙여도 될까요? 다음 주로 실험을 모두 미루자니 빨리 결과를 보고 싶고, 주말에는 개인 사정이 있어 실험을 못하는 상황입니다ㅠㅠ 
회원작성글 hazzy  |  04.22
Q. western blot band 모양이 이상합니다 ㅠ 첨부파일
8%gel 사용,  t-stat3 밴드를 보는중인데, 중간에 밴드가 내려와있고 그 옆옆의 밴드는 또 올라가 있는 이상한 밴드가 나왔어요 ㅠ 혹시 왜이런지 아시는 분 계시면 감사하겠습니다 transfer 후 폰슈에서 확인 했을 경우에는  괜찮았는데 detection찍으니 이렇게 찍히네요..왜이럴까요 ㅠ
회원작성글 치킨마니아  |  04.21
Q. VSV-G antibody를 이용한 western blot band 두줄
안녕하세요 입사 한달 차 신입입니다 Anti-VSV-G Antibody (kerafast, [#8G5F11]) 를 1차 항체로 하여 바이러스의 western blot을 진행하고 있습니다. 같은 항체를 사용한 이 전 실험(정확히 같은 시료는 아님)과 기타 다른 레퍼런스에서도 두 줄이 나오지 않았는데, 제가 하고나서 부터 자꾸 두줄이 뜹니다. 결과는 깔끔한데 band가 두줄이예요. gel은 만들지 않고 사서 사용 하고 있습니다.(10%) transfer time은 50V, 120min 진행하고 있습니다.   영향이 있을 요소가 무엇이 있을까요?   알려주시면 감사하겠습니다.  
회원작성글 피자도우줘요  |  04.20
Q. western blot LC3 band가 이상해요ㅠㅠ 첨부파일
안녕하세요 western blot 초보자입니다 ㅠㅠ 할 때마다 LC3에서 계속 밴드가 물결치듯이 나와서  뭐가 문제인지 답답해서 질문드립니다ㅠㅠ 다른건 괜찮은데 왜 LC3에서만 저렇게나오는지 도움주시면 감사하겠습니다.    
회원작성글 연린이  |  04.20
Q. western blot 고수님들 도움 부탁 드립니다ㅠㅠ 첨부파일
안녕하세요. 요즘 엑소좀 샘플로 western blot 중인데 2주째 해결이 어려운 문제가 있어 도움 요청 드립니다. 5가지 항체(CEA, PDGF, CD63, PSMA, CCK4) 보는 중인데 같은 날에 동일 조건으로 진행했을때 CEA, CD63은 결과가 정상적으로 보이나 나머지 세 항체는 사진과 같이 background가 까맣게 뜨고 밴드는 흰색으로 뜹니다,,, 구글링해보니 signal이 너무 강해서 그렇다는 말이 있어서 1. 2차 antobody 농도 줄이기 2. 1차 antibody 농도 줄이기 3. protein loading양 줄이기  이렇게 3가지 방법 시도해 보았으나 똑같이 저렇게 배경은 까맣게 뜨고 원하는 위치에 밴드는 아예 뜨지 않습니다ㅠㅠ 항체(cck4, PSMA, PDGF)는 1차 항체 1/1000, 2차 항체 1/40000 이렇게 희석해서 사용하였으며 항체는 주문해서 바로 사용한 것이라 크게 문제 없을 것으로 생각됩니다.  cf. 다른 항체(CEA, CD63) 사용했을때에 비해 자동 exposure시 exposure 시간이 길어지는데 혹시 너무 signal이 약해서 이렇게 뜰 가능성도 있는지요? 거의 2주 넘게 이 문제로 계속 고통받고 있습니다.... 비슷한 경험이 있으신 분들의 조언 부탁 드립니다.   
회원작성글 신짱구  |  04.18
Q. western blot시
WB할 때 얼렸던 sample을 녹여서 vortexing 후 spin down하고 laoding sample을 제작하는데요, spin down 후 추가로 pipetting을 해주고 sampel을 따는게 좋을까요? 아니면 vortexing을 했으니 상관없을까요?
회원작성글 미묘  |  04.17
Q. 베타아밀로이드 웨스턴 블롯 밴드가 안나와요
휴먼 신경세포 SH-SY5Y 에서 5kD 크기의 베타아밀로이드를 웨스턴 하려고 하는데 도무지 밴드가 잡히질 않네요. PVDF 멤브레인을 폰슈로 염색해보면 밑으로 갈수록 밴드가 희미해져요 15% tris/bis-acrylamide 젤을 사용하고 transbuffer는 tris/glycine buffer 에 20% 메탄올과 0.1% sds 를 혼합해 만듭니다. 멤브레인은 0.2um PVDF 를 매탄올에 활성화 해 사용해요 transfer 시간은 100v 1시간, 100v 두시간, 20v overnight, 10v overnight 다양하게 해봤습니다. 베타아밀로이드나 그정도 크기 단백질 웨스턴 진행해 보신분 어떻게 하셨는지 알수 있을까요?
회원작성글 AGCT  |  04.14
Q. NFkB MAPK Signaling Western Blot 도와주세요ㅠㅠㅠㅠ
cell을 이용해서 nfkb mapk pathway를 보려고 하는데요 저는 cell pellet을 lysis buffer를 이용하여 웨스턴블롯을 수행하고자 합니다. 그런데 저는 그냥 cell signaling사의 total nf kb를 보려고 하는데 phospho 형태를 봐야하는지 의문이 생겨서요,,,,    NFKB는 비활성상태에서 IkB가 붙잡은 형태로 세포질에서 존재하기 때문에 핵에 못들어 가는 걸로 알고 있습니다. 후에 IkB가 활성화되어 제거 되면 NFKB가 핵으로 들어갈수 있게 되고 염증 매개체들이 분비가 되는걸로 알고 있는데요,  (IKB phosphorylation > IKB degradation >  NFkB nucleus로 이동 > transcription) 이 과정을 보기 위해서는 그냥 위에 말한대로 WB을 수행해도 될까요? 아니면 phospho-NFkB를 봐야할까요??   제발 알려주세요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 sjsj3636  |  04.11
Q. sds page의 분석에 어려움을 겪고 있습니다...
sds page 실험을 했습니다. 보시다시피 결과가 매우 좋지 않고 분석하는데 어려움을 겪고 있습니다. 각 lane마다 이게 smared된 것인지 여러 종류의 단백질이 분리된 것인지 알아보기가 어렵습니다.. 혹시 방법이 있을까요..? 다시 실험할 기회가 없고 레포트를 적어서 내야 합니다...
회원작성글 dbeopqe  |  04.10
Q. western blot antibody
안녕하세요 western을 하다가 결과가 나오질 않아 질문을 하게 되었습니다.    저의 첫 western은 지난번 실험의 결과로 자신감을 얻었고, 이번에 새로운 antibody를 하려고 하였습니다.  근데 또 같은 문제로 결과가 나오지 않아 메일을 드리게 되었습니다.       1차 안티바디로 actin을 1:3000으로 지난번에 동일 방법으로 4도씨에 overnight을 하였고,  이후  PBST로 10분씩 3회 washing하고  사진과 같은 Rabbit antibody를 1:5000으로 실험을 진행해보았습니다.   근데 결과가 전혀 나오지 않았습니다. 지난번에는 1,2차 안티바디를 동일한 안티바디를 사용해서 결과가 안나왔습니다. 근데 이번에는 왜 결과가 안나왔는지 모르겠습니다.    혹시 이번에도 지난번과 동일하게 1,2차 안티바디가 동일한건가요? 아니면 1차에는 actin을 붙히고, 2차는 nrf2 안티바디를 사용해서 그런가요??   아... 정말 어렵네요 ㅜㅜ 오늘도 다른 방에서는 연구원분이 실험하는거 하나하나 알려주시는데 진짜 울컥합니다 ㅜㅜ  제발 알려주세용 ㅠㅠㅠ 
회원작성글 AD석사생  |  04.08
Q. western blot 결과가 안나와요 ㅜㅜ
안녕하세요^^   이제 막 스스로 혼자서 cell 키우고 protein 정량하고 western blot까지 이제 막 해본 사람입니다.   western blot trasnfer하고 안티바디를 붙히고 detection을 하였는데 결과가 나오질 않습니다.   문제점이 무엇인지 모르겠습니다.   1. membrane을 1시간 동안 건조시킵니다. 2. skim milk 20mL 로 5%  1시간 shacking (1g 충분한 voltexing) 3. PBST로 10분간격으로 3회 washing하였습니다. 4. 냉동보관되어 있는 actin 1: 1000을 skim milk 3%로 1:2로 하여 1:3000으로 하여 4도씨에서 overnight 하였습니다.  (여기서 냉동보관되어있는걸 사용하여 그런건지 모르겠습니다.) 5. PBST로 10분간격으로 3회 washing 하였습니다. 6. 냉동보관되어있는 beta actin 1:5000을 ice에서 녹인후 소량(충분히 멤브레인에 잠길정도)로 하여 1시간 shacking하였습니다.  (여기서도 냉동보관을 사용해서 그런건지 모르겠습니다.) 7. PBST로 10분간격으로 3회 washing하고, ECL 1:1로 하여 detection하였습니다. 결과는 첨부파일과 같습니다.  marker가 삐뚤다는것도 알고 잘된 실험이 아니라는것도 압니다. ㅜㅜ 프로토콜과정에서 문제가 있는지 궁금합니다.    혹시 몰라 PBST로 10분간격으로 3회 washing후 4도씨에 PBST와 함께 통에 보관 중입니다. 
회원작성글 AD석사생  |  04.05
Q. western detection
안녕하세요 western을 처음 진행하는 사람입니다. detection을 할때 clarity max western ecl substrate이거랑 clarity max western ecl substrate 이게 혹시 ECL solution A와 ECL solution B 인가요??    
회원작성글 AD석사생  |  04.05
Q. 웨스턴 상에서 과발현 단백질의 tagging 항체와 단백질 항체의 detection 차이 첨부파일
안녕하세요. 저는 flag-A, his-B 라는 단백질을 HEK293 세포에 과발현하여, WB으로 flag와 A 단백질 항체로 detection 하였는데요. (* B 단백질은 A의 adaptor 역할을 하고, A, B 가 같이 발현이 되면 두 단백질의 stability 와 activity(phosphorylation)이 증가한다고 알려져 있습니다)  사이즈가 달라서 고수님의 의견을 여쭙습니다.  첨부파일을 확인해 보시면, 1) Lane 3에서  단백질 A와 B를 co-expression 할  경우,  band 1 의 total A 경우 65KDa 위치에 broad 하게  잡히고, (사전논문에도 그렇게 나오고, phosphorylation 증가때문에 그렇다고 합니다.) 2)  band 2의 Flag 의 경우 75KDa 위치에 band가 비교적 sharp 하게 잡힙니다. 그래서 제 질문은,  Q1)  Flag - A 단백질을 발현하였으니, 1), 2) 둘의 위치가 같아야 하는게 맞는데 왜 차이가 나는 것인지 모르겠습니다. 사전 논문에도 A 단백질의 일부가 잘린다고 나오지 않습니다. 그리고,  Q2)  만약 잘리지 않고, A 단백질의  phosphorylation 같은 modification 이 많이 되는데, 그 영향이라하면 그럼  SDS-gel 상에서 무게가 무거워서 band 가 더 위로 나와야 하는거 같은데요.. 왜 더 작게 나오는 것일까요? 그러면 flag에도 잡혀야 될거 같은데요.. 결과해석하는데 막혀서 도저히 답이 나오지 않아서, 브릭의 고수님께 질문드립니다.  감사합니다. 
회원작성글 초록분홍  |  04.04
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