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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Pull-down Assays
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Q. western 조언부탁드립니다. 첨부파일
western을 통해서 glucocorticoid receptor(GR)의 인산화되는 경향을 보는 실험을 하고있습니다.phospho form을 보기전에인산화되기전의 total GR을 western으로 보기위해control인 beta-actin과 total GR을 western했습니다.사진에서 나타나는 순서대로 1. control 2. negative control 3. positive control 4. 실험군이고 2반복 진행했습니다.2반복째 베타액틴은 일정한 밴드가 나오지 않았지만1반복에서의 베타액틴은 어느정도 일정한 경향을 띠는데 문제는 positive control에서의 total GR입니다.예상 결과는 total GR의 경우는 일정한 경향의 밴드가 떠야하는데positive control의 경우만 너무 약한 밴드가 뜹니다 ㅠㅠ뭐가 문제인건지 정말모르겟네요..베타액틴에서 비슷하게 나온걸로봐서 단백질은 일정한 양 로딩한것같은데왜 total GR이 다르게 나오는 걸까요?ㅜ어떻게 해야할지 조언부탁드립니다.
western  |  2013.09.15
Q. 시약 문의좀 드리겠습니다.
저희랩에서 급하게 실험을 해야하는데요 사용하고자하는 시약이 국내에 재고가 없어서빌려쓰고자 합니다.1. Phosphotyrosine Ab (밀리포어 05-321)2. Tie2 Ab (산타크루즈 SC-324)3. Protease and phosphatase inhibitor mini tablet (pierce 88669)4. Fibronectin 1mg (sigma F0895)위의 4가지 시약이구요여분으로 가지고 계시면 저희좀 빌려주시면 새제품으로 구매하여 드리겠습니다.
protein  |  2013.09.03
Q. Polystyrene magnetic bead 를 이용한 precipitation 시에..
안녕하세요.지금 polystyrene paramagnetic bead (Spherotech) 를 이용한 protein-protein interaction 실험을 IP로 진행중에 있는데요.제가 아직 실험 초보인 학생이라서 궁금한 것이 생겼는데요.실제 bead 에는 아무것도 labeling 이 되어있지 않는데,교수님은 protein(A) 와 A에 결합하는 bacteriophage 를 결합시킨 후 해당 bead를 이용하여 precipitation 을 하라고 하시네요.그런데 protein A 나 bacteriophage 나 둘 다 biotin 같은 tag 이 labeling 되어 있지 않아요;bead도 그냥 non-labeled bead 이고요.그래서 혹시 자성 때문에 생긴 공간에 bacteriophage 같은 macromolecule이 capture 되는 건지,아니면 polystyrene magnetic bead 의 어떤 특별한 특성?이 있는건지 궁금하네요.이도저도 아니라면, 제가 뭔가 실험과정을 잘못 이해했을수도 있겠네요;
Hunterx  |  2013.08.30
Q. coIP 실험 관련해서 질문이 있습니다.
우선 저는 coIP 실험은 처음이며, 온라인에 있는 protocol들과, roche에서 제공하는 protocol을 참고하여 실험을 하였습니다.(proteinA-agarose를 roche에서 구입)저는 mutant cystein protease의 한 종류를 이용한 실험중인데,mutant가 substrate sequence와 interaction은 잘 하는지 보고자 합니다.그래서 protease inhibitor를 처리할까 하다가 제가 사용하는게 protease라 처리하지 않았습니다.그리고 IP 실험을 쭉 진행하다가, substrate-protease-Ab-proteinA complex를 형성시킨 후원심분리를 시켰는데, pellet이 눈에 보이지 않네요... 정말 희미하게 뭔가 보이는것 같아서, 있다고 생각하고 실험을 하긴 했습니다.(결과는 기다려봐야 알겠지만)(제가 아낀다고 proteinA-agarose를 10ul밖에 쓰지 않긴 했습니다.)제 질문은 아래와 같습니다.1. protease inhibitor를 처리를 안해서 degradation 되었을까요? 4도 혹은 ice에서 항상 실험하였고, 하루정도 걸려 실험했습니다.2, proteinA의 size는 42kDa이라고 검색되는데, agarose와 covalent binding되어있어서 원심분리하면 가라앉게 되는건가요?3. agarose는 당이라고 검색되는데, protease에 의해 분해되진 않겠죠? 혹은 agarose가 잘려서 pellet으로 가라앉지 않는 경우가 있을까요?4. 보통 proteinA를 어느정도 사용하시나요? 제가 구입한 제품의 proteinA의 농도는 알수 없지만, 10ul면 100ug 정도의 antibody가 붙을 수 있다고 계산됩니다. pellet이 잘 안보일정도로만 사용해도 되는건가요? 아니면 더 많이 사용해서, pellet이 확실하게 보이도록 해야하나요?5. Antibody도 비싼지라, 2ul(400ng)씩 사용했습니다. proteinA에 비해 상당히 적은 양인데, 이정도면 western으로 detection이 가능하겠죠? coomassie stainning으로는 어렵겠죠?6. coomassie로 한다면 proteinA는 agarose에 의해 얽혀있는 상태라 42kDa이 아닌 더 큰 사이즈에서나 혹은 엄청 위에 나오겠죠?7. proteinA-agarose가 갈색병에 담겨있었는데, 빛을 받으면 안좋은 것은 아니죠? 8. 가라앉아 있는것을 잘 풀어준 후에 분주했습니다. 분주하고 보니, 원래있던 통에 건더기가 약간 남아있긴 했었는데, 그리 많진 않았습니다. 이렇게 분주해서 사용해도 문제 없겠죠?질문이 좀 많네요. 고수님들의 친절한 답변 부탁드립니다.
회원작성글 순똘  |  2013.08.17
Q. ATPase activity 측정하려고 합니다 ㅠㅠ 도와주세요 ㅠㅠ
malachite green phosphatase assay를 통해서 실험을 하려고 합니다.기본적인 원리와 참고논문은 브릭 서치로 알아서 참고하였습니다.기본원리입니다 :The Malachite Green Phosphate Assay Kit is based on quantification of thegreen complex formed between Malachite Green, molybdate and freeorthophosphate. The rapid color formation from the reaction can beconveniently measured on a spectrophotometer (600 - 660 nm)그런데 lysis buffer를 어떻게 해서 써야 할지를 모르겠습니다. ㅠㅠ저는 s.mutans로 실험을 하는데 어떤 lysis buffer를 사용해서 atpase assay를 해야할지 모르겠습니다 ㅠㅠ혹시 이 assay kit 나 이외의 방법으로 atpase 를 측정해 보신적이 있으시면알려주시면 감사하겠습니다 ㅠㅠㅠ
회원작성글 Astrocyte  |  2013.07.18
Q. IP 시, pre-clearing 시간
IP 과정 중 pre-clearing 과정을 수행하고 있습니다. 4도에서 1시간 rotation 하려고 했는데, 깜빡하고 rotator 스위치를 켜놓지 않았네요..ㅠㅠ -_-1시간 더 rotation 시키려고 하는데 pre-clearing 과정이 길어져도 상관없는지요.. ㅠㅠ아 그리고 control IgG 대신 serum을 사용하는데 보통 얼마나 넣어줘야 하는건가요? 대강 5 ul 넣었고, Ab binding 과정에는 negative control 로서 10 ul 정도 첨가하려고 하는데이정도면 충분한가요? IP 초보라 모르는 것이 많습니다 ㅠ답변 부탁드려요..
학생  |  2013.07.17
Q. Blue native PAGE라는 실험에 대해 알고 싶습니다
프로토콜은 정말 많이 떠도는데 원리에 대해선 찾기 정말 힘드네요 ㅠㅠprotein과 chemical, protein과 protein간 intraction 을 알아보기 위하는 실험이라고 알고있습니다만 CO-ip, yeast two hybrid같은 실험과는 어떻게 틀리고 장점이 뭐고 단점은 뭔가요? 원리를 알기 힘들어서 파악하기 힘드네요 ㅠㅠ그나마 올라와있는것도 이해가 잘안되는 ㅠㅠ 부탁드립니다 고수님들
프라이머리  |  2013.07.13
Q. transcription factor binding partner
transcription factor (protein A)의 binding partner를 보고자 FLAG-tagged protein A를 cell에서 overexpression 시킨후에 nucler fraction 만들고자 합니다.이 경우 nuclear lysate를 바로 FLAG 컬럼을 통해 정제를 하게 되면 binding partner도 함께 분리 정제가 가능할까요?아니면 cross-linking을 시킨후에 컬럼을 통과시키는 방법이 더 좋을까요?
bio  |  2013.07.11
Q. α-Glucosidase assay protocol 문의드립니다.. ^^
α-Glucosidase assay protocol 문의드립니다.. ^^저는 천연물 샘플을 가지고 항당뇨 연구를 하려고 준비중인 석사 1기생 입니다.관련 assay중 α-Glucosidase inhibition activity를 측정하는 assay 의 protocol을 구하고 있습니다.항당뇨 연구 자체가 처음이어서, 넣는 시약이나 샘플의 양과 농도 등 자세한 사항이 나와있는 자료를 구하고 있습니다ㅠ_ㅜ..!소장하고 계신 자료중에 처음시작하는 학생을 위해 좋은 자료가 있으신 분은 아래의 메일 주소로 보내주세요...! 부탁드립니다..!909ehd@naver.com
회원작성글 bona88  |  2013.06.28
Q. immunoprecipitation (ip) 타켓에 대한 질문이요.
요즘 ip 실험 관련하여 셋팅중에 있습니다....WB는 많이 해봤지만 IP는 거의 안해봤는데요,이번에 IP 에 대해서 제대로 셋팅을 해야할 상황에 있습니다. 딱히 어떤 주제에 대한 타겟이 있는 상태는 아니구요..일단 IP프로토콜에 대한 검증이 필요하기 때문에 초보자도 잡을수 있는 타겟으로 정하려고 합니다.이왕이면 약물이나 스트레스를 주지 않은 노멀 상태에서 바인딩 하고 있는 두개의 protein 을 정하면 좋을것 같은데요.....지금 생각하고 있는건 apaf-1 과 caspase-9 인데요... 실제로 무난하게 잘 잡히는 놈들인지... 감이 안오네요ㅠ고수님들의 답변 기다리겠습니다.
ip초보  |  2013.05.22
Q. Co-IP 후 washing
binding partner를 찾고자 co-IP를 하였습니다..처음 계획은 LC-MS/MS를 이용해서 binding partner를 찾고자 함이었거든요..그래서 IP후에 washing은 PBS 로만 해주었습니다.그런데 elution후에 gel을 걸어보니 거의 lysate를 loading 한거 만큼 여러 단백질이 보이네요..non-speciifc binding을 줄여야 할거 같은데요..어떤 washing buffer가 좋을까요? 감사합니다...
bio  |  2013.05.12
Q. ip할때 단백질간의 결합때문에 항체가 못붙을수 있나요?
Affinity capture,ms 로 상호작용한다는걸 알았고 ip로 확인하려는데 잘 안잡히네요안티바디는 잘 워킹하는것 같은데요...
헤헤  |  2013.05.08
Q. Cell surface biotinylation assay의 internal loading control로 무엇을 써야 할까요?
안녕하세요. 저는 이번에 surface biotinylation assay를 이용해 cell 표면의 특정 protein양이 감소 또는 증가하는 것을 보려하고 있습니다. 그런데 avidin-conjugated bead로부터 elution된 protein이 gel에 동량이 loading되었다는 것을 보여주려 하는데 surface protein의 internal loading control로 무엇을 써야 할지 모르겠습니다. Total lysate에 대한 loading control로 beta actin, GAPDH, tubulin 등을 사용하는 것처럼 cell surface에서도 일정하게 발현되는 protein이 있으면 좋은 control이 될 것 같은데 아직까지도 못 찾고 있습니다. surface biotinylation assay를 사용했던 paper들에서 보면 예를 들어 tubulin에 대해 western blot을 했을 때 total에서는 band가 detection되고 surface에서는 band가 나타나지 않는 것으로 surface protein만 biotinylation되었다는 것을 증명하고는 있지만 동량의 surface protein이 loading되었다는 것은 보여주고 있지 않더라구요. 그만큼 surface biotinylation assay가 정확한 실험이라 사람들이 control을 사용하지 않는 걸까요? 아니면 제가 아직 못 찾은 걸까요. 경험있으신 분들의 조언 부탁드립니다.
leshay  |  2013.04.29
Q. 논문을 작성중인데 IP라고 할지 Pull down 이라고 할지 조언을 구합니다.
제가 한 실험을 논문에 적는중에 어떻게 figure를 표현해야 하는지 궁금하여서 올립니다.실험목적은 두 단백질의 interaction을 확인하고자 하였습니다.1. cell에서 Flag tagging된 kinase를 IP를 하여 bead에 Flag kinase를 붙입니다.2. 그 후 E. Coli에서 정제한 recombinant protein을 이용하여 immobilized Flag kinase와 반응시켜서 얼마나 interaction하는지 WB으로 확인합니다..원래는 IP로 생각하고 적고 있었는데,다른 명칭으로도 표현을 하는지 확인을 해보라고 해서 이렇게 올립니다..figure내용에도  IP : Flag로 표기했거든요..
논문작성중..  |  2013.04.26
Q. Co-IP가 잘안돼요 ㅜㅜ 도와주세요.
In vitro에서 단백질 분리하여 GST-pull down하면 interaction을 하는데, 293T에서 transfection하여 GST-resin으로 pull down하니 잘 안됩니다. ㅡㅜProtein G column도 이용해보았는데, washing을 적게해서인지 control에도 band가 많이 나오구요..보통 Co-IP할 때 세포양을 얼마나 해야할까요? 물론 interaction 정도에 따라 다르겠지만요..전 100 mm dish cell 중 반 정도를 썼습니다. 그럼 꼭 조언 좀 부탁드려요~
kre  |  2013.03.14
Q. 전사인자 단백질간 결합부위 찾기!
안녕하세요.제가 전사인자 단백질 두개간의 결합부위를 찾고 싶은데293 세포나 Hela 에 단백질의 일정부분을 pcDNA에 cloning 하고,cotransfection해서 IP 할때,만약 자른 부분이 NLS가 없어 핵안으로 들어가지 않아두 단백질이 bindindg 안하는 것처럼 생각될 수 도 있지 않나요?전사인자 단백질의 도메인 연구 하실때 어떻게 하시는지 궁금합니다.
실험왕  |  2013.03.08
Q. coniferyl alcohol은 어디에 녹나요?
coniferyl alcohol은 어디에 녹나요????????????????????????????ㅜ
715-2  |  2013.02.20
Q. DNA, protein immunoprecipitation(IP)
DNA/protein IP 관련 문의드립니다~~(첨하는 실험이라서요^^)A라는 gene이 B sequence에 binding 할 꺼라 생각되어 DNA/protein IP 실험을 하고 있습니다.먼저..A를 transfection 시킨 후 nuclear extract를 얻었고...B부분을 biotin labeling 했습니다(아래 sequence는 예로 쓴것이구요,길이는 20mer, sense와 antisense부분 5'쪽에 biotin으로 labeling 했습니다-->제작의뢰)(biotin-5'-ATTGGGTTT~~~GGCTCT-3'(20mer)...           3'-TAACCCAAA~~~CCGAGA-5'biotin(20mer)다음에는...sense와 antisense를 각각 4ug씩 넣고 annealing buffer넣고 total volume이 20ul되도록 나머지는 DW로 채우고 95도에서 5분 반응 시킨 후(heat block) 전원을 끄고 온도가 약 25도 정도가 될때 까지 sample을 heat block에서 천천히 cooling 시킵니다..이렇게 준비된 probe와 nuclear extract 400ug, streptavidin agarose bead 20ul를 섞은 뒤total volume이 500ul가 되도록 NP buffer(+inhibitors)로 채웁니다..그리고..RT에서 2시간 incubation 합니다.(rotator)incubation이 끝나면 NP buffer(+inhibitors)로 세번 washing 하고(centrifugation은 550g로 1분동안) 2XLaemmli넣고 95도에서 5분 heating 하고 western을 진행했습니다...A가 flag으로 tagging되어있어 primary Ab를 flag을 사용한 결과 IP한 곳에서는 아무런 band가보이지 않았고 total lysate에서만 band가 형성이 되었습니다..nuclear extract가 잘 뽑혔는지는 PARP로 확인을 했습니다...제가 실험한 과정에서 잘못된 곳이 있는지 가르쳐 주시면 감사하겠습니다~그럼 좋은 하루 되세요~~   
궁금이  |  2013.02.12
Q. sds 질문입니다
TRAIL을 분리 한뒤 SDS를 달렸는데70kDa 위에는 나오지 않아야 하는데 끌리듯이 나오네요.ㅠㅠ같이 실험한 다른분은 70KDa윗부분이 거의 안보이는데무엇이 문제일까요?단순히 TRAIL이 깔끔하게 분리되지 않아 불순물이 섞였을 수도 있다는 원인 말고어떤과정을 수정해야 윗부분을 안보이게 할 수 있을까요?
sds  |  2013.02.12
Q. 단백질구조 관련 질문좀요.ㅠㅠ;
안녕하세요. 생명공학  이제 처음배우는 완전 초짜입니다.ㅠㅠ;제가 특정 antigen을 만들려고하는데요 ..  그럼 epitope에 반응을 해야되고..그게 공부해보니까 유전자마다 특징이 있어서 N-terminus, C-terminus, 중간부분을 쓸지결정을 해야되더라고요.. 그 중에서도 PGP9.5 와 GFR Alpha-1이라는 유전자를 사용하여 antigen epitope를 디자인 할건데... PGP9.5 같은경우에는 cytoplasm이라서 전체부분을 써도 무방하지만,GFR Alpha-1같은 경우는 단백질 3차구조중에서 surface-oriented, 즉 membrane바깥쪽에 있어야 epitope로 인지해서 잘 만들어진다고 하더라고요..여기서 질문좀 할게요.어떻게 membrane 바깥쪽, 표면에 있는 부분인지 알 수 있나요? 제가 알고있는건 유전자의 mRNA, protein sequence만 알고 있는데, 따로 프로그램같은거라도 사용하는건가요?? 허접한 질문이지만 소중한 답변 부탁드리겠습니다 ㅠㅠ;p.s 아 그리고.. design하려는 부분을 찾았으면 앞뒤로 primer도 짜줘야되는건가요..?ㅠㅠ;
회원작성글 self  |  2013.02.05
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