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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
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Q. 단백질 정량 관련 - total, soluble, insoluble
안녕하세요. 환경공학 석사 2학기 과정 대학원생입니다. 생물 실험 관련하여 여쭤볼게 있어 질문 올립니다. 미세조류내 total protein의 양을 정량하고자 실험을 진행하고 있습니다. 정량 프로토콜은 1. sample의 원심분리를 통한 pellet 생성 (PBS washing 3번) 2. pellet을 RIPA buffer로 resuspension 3. microtube 2ml 넣고 sonication bath에서 10분간 sonication 4. 원심분리 후 상층액을 따서 BCA 정량키트로 단백량 확인. 입니다. 여쭤보고싶은것은 1. 전반적으로 실험과정에서 문제가 있을지.  2. 4번에서 상층액의 단백질은 soluble단백질이라 하였는데, 그렇다면 total 단백질의 양을 알기 위해서 pellet의 insoluble 단백질양은 어떻게 확인 할 수 있을지 여쭤뵙니다. (RIPA Buffer에 SDS 1%를 추가로 넣으면 단백질에 음전하를 띄게하여 insoluble도 같이 상층액에 녹는다는 말을 들었는데, 정확한 레퍼런스가 없습니다.) 추가실험으로 western blot 등은 하지 않을 것이고 total protein의 양만 알면될거 같습니다.  생명공학이 주전공이 아니라서 짧은 지식 양해부탁드립니다. 선배님들의 조언 부탁드립니다. 감사합니다.
회원작성글 불가리스  |  2020.04.14
Q. protein 분리방법,,,,
안녕하세요... protein 두가지를 cleavage site로 연결 시켜 놓은 것을 enzyme로 digestion하여 두가지 protein을 분리 시키려고 합니다. 1번째 protein은 16kDa이고 2번째 protein은 7kDa이라서 10k filter를 이용하여 protein을 분리하려고 하였으나 weston결과를 보니 전혀 분리 되지 않았습니다. 상층액에 있던 solution을 회수하여 weston 같이 했는데 거기에 7kDa인 protein도 있더라구요 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 10k filter다음에는 30k라 선뜻 하지 못하고 있습니다. ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 고수님들 조언부탁드립니다.   어떻게 해야 yield 좋게 분리 할 수 있을까요??ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 초보석사쌤  |  2020.04.09
Q. Protein extraction 관련하여 질문드립니다
Raw 264.7 cell의 protein extraction을 진행하였는데, Western blot을 통해 분석결과, p-form의 LPS 무처리군의 p-ERK 발현이 억제되어야 하는데, 억제되지 않았고 오히려 LPS 유도군보다 높은signal이 나왔습니다. ERK signal은 일정하였습니다.   protein extraction은 4℃ PBS wash 후 cell scrap하여 수거한 후 RIPA buffer (1X protease and phosphatase inhibitor cocktail)로 lysis 하였습니다. Bradford standard curve를 이용하여 정량 후 western blot에 사용하였습니다.     확인해본 결과 cell상태에는 이상이 없었고, western blot의 과정보다는 단백질 추출 과정에서 문제가 있었던 것 같은데, RBL-2H3 세포에서도 같은 문제가 발생되어 도움을 구합니다ㅠㅠ        
회원작성글 orangee  |  2020.04.08
Q. 단백질 정량 측정 관련
.단백질의 질량을 직접 추정하려고 하는데, 값들이 다 비슷해야 하는 것 아닌가요? 어디에 문제가 있는 걸까요? 부탁드립니다 ㅠㅠ
회원작성글 생명러버  |  2020.04.08
Q. lysis buffer 조성이 western blot 밴드 위치에 차이를 줄 수 있을까요?
제가 보고자 하는 한 단백질이 abcam 등 항체 업체들의 데이터시트에서는 20~25kda 사이에 나오고 있습니다.(약 22kda) 그런데 제가 western blotting을 하면 꼭 25kda이나 그보다 약간 위에 나오고 있습니다. 제가 사용하는 gel 은 12% 아크릴아마이드 겔입니다. 이런 차이가 혹시 lysis buffer 떄문에 오는걸까 싶어서 저희 연구실에서 사용하는 lysis buffer 조성을 올려봅니다. 포스포폼을 볼 때는 50mM Tris(Ph 7.4) 150mM NaCl 1mM EDTA 0.25% deoycholate 1% triton X-100 phosphatase inhibitor(sigma) protease inhibitor(roche) 위와 같은 조성을 사용하고 있고   일반적인 조성 및 조직은  50mM Tris(Ph 7.4) 150mM NaCl 1mM EDTA 2mM Na3VO4 1mM NaF 0.25% deoycholate 1% triton X-100 phosphatase inhibitor(sigma) protease inhibitor(roche) 를 사용하고 있습니다.    제가 본 밴드 쉬프팅 현상은 포스포폼을 보는 lysis buffer를 사용했을 때 나타난 현상이었는데요, 저정도의 밴드 쉬프팅은 있을 수 있는 것인지, 만일 그렇지 않다면 제 라이시스 버퍼에서 뭘 고쳐야할지 알려주시면 감사하겠습니다.  
회원작성글 클레엉  |  2020.04.06
Q. NI-NTA resin 공기 노출시 아예 사용못하나요?
  레진으로 단백질을 내리다보면 가끔 완전 자동화 시스템이 아니다 보니   잠깐사이에 버퍼가 다 내려가서 노출되거나 그럴때가 있는데   또 학생들이 사용하다가 실수하는경우 그럴때마다 급하게 버퍼나 알콜버퍼를 넣어주긴하지만.. 우선 그런 한번 노출됬던 레진들은 따로 보관을 해두기는 했는데..   레진은 보통 반영구적으로 계속 사용가능한데   이렇게 잠깐동안이라도 한번 쫙 노출되었던 것들은 아예 사용을 못하는지   아니면 다시 풀어서 알콜로 한번 세척후 다시 충전해서 써도되는지요?
회원작성글 타미  |  2020.04.03
Q. 알파 시뉴클레인(alpha synuclein) 올리고머 or 피브릴을 모노모(monomer)형태로 잘라주는 약물 질문드립니다.
알파 시뉴클레인올리고머 or 피브릴을 모노모(monomer)형태로 잘라주는 약물 질문드립니다.    프로테아제나 kallikrein-6 처럼 알파시뉴 피브릴이나 올리고머를 듬성듬성 잘라주는 약물 말로 아에 모노머 형태로 잘라주는 약물이 있을까요..? 
회원작성글 실험보이  |  2020.03.31
Q. Lysis buffer를 필터링 해도 문제가 없을까요?
뭔가 찝찝한 기분을 떨쳐버릴 수 없어서... 오토클레이브를 하면 detergent의 활성을 잃어버린다고 배웠는데 그래서 필터링을 해보려 합니다. Detergent는 np-40/sds 사용 중입니다 (목적에 따라 2가지로) 필터링 (0.45, 0.2) 해도 문제가 없을까요?
회원작성글 Ferredoxin  |  2020.03.30
Q. ELISA 정량 방법 질문있습니다!
ELISA 결과가 너무 반대로나와서 정량을 하고 해야할거같아서 요 Ex) MMP-1 이 UVB자극에의해 HaCaT cell 에서 유발이되야하는데 오히려 Control에서 더많이 발현이일어나요... Hyaluronan 경우에는 UVB자극에의해 HaCaT cell에서 감소해야하는데 오히려 UV자극에의해 유발이일어나서.. 4번을 실험했는데 4번다 비슷한결과가나왓습니다 cell수는 일정하게 했습니다.   상층액은( serumfree 상층액입니다) 그래서 BCA나 Bradford assay를 이용해 상층액 정량후 ELISA 진행을하려하는데 혹시 이래도 맞는건지 궁금해서 여쭤봅니다! ELISA Kit 은 모두 DUOSET 으로 이용하고있습니다 결과가 너무이상하게나와서 속상하네욤 ㅠ_ㅠ..    UV조사했을경우 Celldeath가 20~30%정도 일어나는데  정량을 안해서 인지... 어떻게해야 결과가 나올런지원.. 혹시몰라 정량해서 해보았는데 결과가 원하는대로 나오긴했는데 이게 과연 옳은건지 궁금합니다!
회원작성글 구구갸갸  |  2020.03.29
Q. RNA 및 단백질 추출 관련 질문입니다.
  생쥐 조직을 떼어 얼려둔 샘플이 있습니다. RNA와 단백질을 같이 분리하고자 하는데, 전부 동일한 부위라면 막자로 조금만 부숴 일부는 RNA, 일부는 단백질 분리에 사용했을텐데 부위에 따라 발현량이 다를 수 있는 조직이라 일부만 쓸 수 없는 상황입니다. 다른 논문에서는 whole로 혹은 부위별로 실험을 진행하는 것으로 보이는데, 이 경우 어떻게 해야할지 질문드리고자 합니다.   1) 막자로 잘게 가루를 만든 뒤, LN2를 더 넣어주어 저어 섞고 (가루를 섞기 위해 LN2를 더 넣어주는 방식) 반씩 나누어 하나는 RNA 추출, 하나는 단백질 추출을 진행할지 2) 전체를 다 가루로 만들어 trizol을 넣은 뒤, 상층액을 RNA로 분리 및 분홍빛 용액으로부터 따로 단백질 추출을 진행할지   위와 같은 고민을 하고 있습니다. 어떠한 방법이 조직 부위별 발현량 편차 없이 비교를 할 수 있을까요?
회원작성글 이피  |  2020.02.27
Q. Native PAGE 기초적인 질문 드립니다
저희 연구실에서 아무도 하지 않았고 프록토콜도 없는 상태입니다. 제가 이번에 하는 연구에서 Native PAGE가 꼭 필요한데 프록토콜도 몰라서 고민이 많습니다ㅜㅜ 찾아봤는데 단백질의 pi 값을 알아야 된다고 하는데.. 저는 바이러스 자체를 내릴 생각이라서 어떻게 해야 할 지 고민입니다.. 그냥 SDS-PAGE 처럼 해도될까요? 그러면 차지가 안걸리지않을까요....
회원작성글 Weierstras..  |  2020.02.21
Q. Trypsin digestion 온도
제가 글라이코펩타이드로 만드려고 trypsin digestion 과정에서 모르고 37도씨 오버나잇해야되는데 60도 오버나잇했는데 영향이 클까요 ㅠㅠ?
회원작성글 윤스몬스  |  2020.02.21
Q. 부분 정제된 저분자 펩타이드의 분석을 하려고 합니다
제 sample은 7kDa 이하로 추정되는 작은 peptide이고, C18 을 거쳐 anion exchange chromatography를 통해 부분 정제된 상태입니다.   peptide의 구조나 시퀀스를 분석하려하는데 제 sample이 trypsin, proteinase K, pepsin 으로는 분해되지 않습니다.  MALDI-ToF 나 N-terminal seq을 맡겨봤지만 위의 이유로 실패하였고, 더구나 현재로서는 완전히 정제된 상태가 아닌지라 다른 단백질이나 peptide가 섞여있는 상태일 가능성 또한 배제할 수 없습니다. peptide가 맞는지 조차 확신할 수 없어서 amino acid analysis를 맡기려 했으나, 이 역시 부분 정제된 시료의 경우 분별력이 없기 때문에 추천하지 않는다고 하십니다....   이런 경우 어떤 실험법으로 분석을 해야하는지 도와주시면 감사하겠습니다.. ㅠㅠ LC/MS 로 분석하는 경우도 있는 것 같던데, 부분 정제된 시료로도 충분히 분석이 가능할지 궁금합니다. 완벽 정제하기에 어려움이 있어서 어느정도 구조 분석을 하려했는데, 그러려면 정제가 필요하고... 굴레에 빠졌습니다 도와주세요ㅜㅜ
회원작성글 감귤참새  |  2020.02.17
Q. solution상의 펩타이드-중금속 complex와 free heavy metal의 분리
500~700 Da 의 heavy metal binding peptide와 중금속을 결합시킨 다음 남은 중금속 또는 제거되는 중금속의 농도를 측정하고자 합니다.  측정은 ICP-MS를 이용하려고 하는데요.. 어떻게 하면 펩타이드-중금속complx 와 free metal 이온을 분리할수 있을까요.   제가 찾아본 바에 의하면, Bio-rad의 chelex-100레진으로 free metal은 잡고, complex는 레진을 통과하여 통과한 시료의 중금속 농도를 ICP-MS로 측정하고자 하는 방법이 있습니다. 그런데 이 레진이 중금속마다 흡착능이 다르고, 잘 작동할까에 대한 의문이 있습니다.    MWCO 100 Da의 ultrafiltration이 있으면 좋을텐데... 없는듯 합니다. 
회원작성글 soi  |  2020.02.14
Q. PVDF 보관법 질문있습니다 첨부파일
안녕하세요 Nc membrane 만 사용하다 처음으로 Pvdf를 사용하였습니다 그런데 어제 1차 디텍션 후 사정이생겨 바로stripping을 하지못했고 바보처럼 별생각없이 NC를 쓸때처럼 증류수에 실온보관하였습니다;; 오늘 stripping 을 하려고보니 첨부와같이 먼저 처리했던 엑틴자국이 있어 당황하였고 우선 tbst로 워싱 중입니다..ㅠ 이미 스트리핑을해도 소용없는 상황인건가요..ㅠ 급하게 찾아보니 말려서 보관하신다는 분도있고 tbst에 담궈 4도에 보관한다는분도있고.. 바쁘시겠지만 조언부탁드립니다ㅠ 감사합니다!
회원작성글 음음  |  2020.02.12
Q. jove 동영상 부탁드립니다 ㅜㅜ
https://www.jove.com/video/51011/-i-?language=Korean jove 동영상인데 볼수가 없어서요 ... ㅜㅜ mhs0005@naver.com 입니다. pdf 파일 부탁드릴게요 ㅜㅜ
회원작성글 Arche*  |  2020.01.31
Q. tissue에서 protein 추출 할 때 2가지 방법
선생님들 안녕하세요 문득 궁금해져서 질문 드립니다. tissue에서 보통 단백질을 추출 할 때 homogenizer 같은 것을 사용해 lysis buffer로 추출을 하실텐데요  brain이나 spleen 처럼 약한 조직은 위처럼 homogenizer를 사용해서 추출하거나 먼저 세포로 분리한다음에 lysis buffer로 할 수 있는데 western 결과를 보았을 때 tissue에서 바로 protein prep 하는 것과 tissue에서 cell isolation 후 protein prep 하는 것에서 차이가 있을까요?   있다면 근거나 원인이 무엇이 있을까요?
회원작성글 모자  |  2020.01.30
Q. SDS-PAGE를 했는데 결과가 당혹스럽습니다. 첨부파일
SDS PAGE를 진행하기 위해 임의로 손에서 얻은 균을 LB agar 배지에 배양 후, 자란 균들 중 colony 하나를 취해 액체 LB 배지에 배양하여 단백질 추출을 진행하였습니다. 균의 단백질을 추출해본 결과 sample1에서는 48μg/ml이 나왔고 sample2 에서는 40μg/ml이 나왔습니다. sample1은 sonication을 진행하였고 sample2는 vortexing만 진행하였습니다. 이 과정에서 sonication을 이미 사용 중인 분이 계셔서 최소 30분 이상 RIPA buffer를 넣은 상태로 지체되었습니다. 균의 단백질 추출의 과정은 protocol을 따라 만들었으며, RIPA buffer의 양을 조금 많이 넣기는 했습니다. (이 이유로 단백질의 양이 적을 수도 있다고 하였습니다.) 적은 양이 검출되었지만 전기영동을 해보아서 나올지 안 나올지와 실험 숙련도의 향상을 위해 진행을 해보았습니다. SDS-PAGE 또한 기본 protocol을 따라 진행하였기 때문에 잘못된 시약을 사용하는 일은 없었습니다. electrophoresis 시 tank buffer를 재사용하기도 하였고(WB시는 문제가 없는데 SDS-PAGE에서도 문제가 없는지는 정확히 확인은 못해보았습니다.) 전기영동시 평소 45mA(80V)로 진행 하였으나 그 날 여러 상황에 의해서 전기영동시 300V로 진행하게 되었습니다. Polyacrylamide gel 과 gel에 분주하는 과정(옆으로 넘치거나 하는 일)에서는 숙련자의 도움을 받았기 때문에 문제가 없었습니다. gel은 만들어 둔지 시간은 좀 지났었으나 4℃에서 tank buffer를 채워서 잘 보관중이였습니다. sample들은 loading dye와 섞어 최종 볼륨이 60μl가 되게 넣었습니다.( 구멍에 최대한 넣기 위해 최대 볼륨을 넣었습니다.) 겔 사진이 없긴 한데 그림으로 아래 첨부하였고 Gel에 좌측부터 3곳에만 sample1, sample2, marker를 넣고 electrophoresis를 진행 한 후 coomassie blue로 염색을 overnight 한 후 오전에 탈색을 진행한 뒤 gel을 관찰해 본 결과 첨부한 그림과 같이 marker는 아주 잘 나왔고 모든 레일에서 2줄의 연한 band가 검출되었습니다. sample이 검출이 연하게 되거나 안 나오면 ‘아 단백질의 양이 적구나’ 라고 생각할 수 있었으나 모든 레일에서 같은 band가 복사 붙여넣기 한 것처럼 같은 모양을 취하고 있었습니다. 이로써 이제 저희의 궁금증이 생기게 되었는데요. 도대체 왜 어떠한 이유로 같은 band가 모든 레일에서 검출이 되게 된 것일까요. 같은 조건에서 재 실험을 해보려고 하였으나 이유를 알고 진행해 보고 싶어 이렇게 질문을 올리게 되었습니다. 어디가 문제일지 몰라서 가능한 다 적으려다보니 글이 길어지게 되었습니다.
회원작성글 참치뱃살  |  2020.01.30
Q. cell lysis 다시해도 괜찮은건가요?
cell harvest 후 곧바로 cell lysis solution 처리하여 protein을 얻었습니다. 실험 후 남은 cell harvest를 버리지 않고 냉동보관 해두었는데 여기에 다기 cell lysis solution 처리하여 protein을 얻을 수 있을까요? 
회원작성글 juyu21  |  2020.01.19
Q. Polymersome(polymer vesicle)에 로딩되지 않은 항암제 분리하는 방법...
안녕하세요 지금 진행하고 있는 실험이 polymer로 만든 입자인 polymersome에 항암제인 doxorubicin을 담지하는 건데요, 담지까진 했는데 그 이후가 문제입니다ㅠㅠ로딩효율을 알려면 담지되지 않은 free-drug를 제거해야하는데 그 방법에 있어서 고민이네요. 제가 크게 3가지 방법으로 진행해봤는데   1. Centrifugation 이거는...일단 pellet자체도 얼마 되지 않고 self-assembly로 만들어진 입자를 물리적인 힘으로 크게 가하면 입자가 부서질거 같아서 하다가 중단했습니다.   2. Membrane dialysis 이거도 진행을 했는데, 문제는 이렇게 해서 free-drug를 제거하고 남은 sample로 in-vitro 실험을 하는데 과연 이게 맞는 방법인가 의문이 듭니다. Membrane dialysis랑 in-vitro랑 유일한 차이점이 in-vitro같은 경우는 온도 37도로 한다는 점과 membrane dialysis는 상온에서 한다는건데..중복된 방법으로 과연 free-drug를 제거하는게 맞는 방법인지 의문이 듭니다.   3. PD-10 column 마지막이 PD-10 column으로 크기가 작은 항암제가 나중에 빠지도록 하는 방법인데 이 방법이 가장 실용적일 거 같아서 현재 진행중인데 여기도 몇가지 궁금한 점이 있습니다. 먼저 실험을 진행해봤는데 문제점이 용매가 제일 먼저 빠져나오는데 그 다음에 입자가 빠져나오질 않습니다..2일이 지났는데도 column에 걸려있고 빠져나오질 않고(항암제도 마찬가지입니다) 있네요. 그 다음 궁금한점은 이렇게 빠져나온다고 해도 이걸 어떤 시간을 기준으로 분리해야할 지 의문이 듭니다.   길지만 혹시 알고 계신분은 답변해주시면 정말 감사하겠습니다 ㅠㅠㅠ계속 찾아보고 있는데 잘 모르겠네요...참고로 입자 크기는 대략 150~200nm정도입니다.
회원작성글 새해엔  |  2020.01.13
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