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[우당탕탕 석사 적응기] 석사 1학기 - 새로운 환경, 그리고 후회
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 카테고리: 전체 > Cell Biology > Cell lysis/Apoptosis
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질문/투표/프로토콜 등록
Q. NFKB, IKB 분해정도 western
안녕하세요. 처음 western을 진행을 하려고 하는데요.  mouse에게 추출물과 알콜을 넣어서 위의 NF-KB발현량을 측정하거나 IKB분해 정도를 western blot으로 확인을 해야합니다.   이론을 보고 디자인을 하고 있는데 제가 생각한게 맞는지 확인 좀 부탁드리겠습니다.   1. NF-kB을 보려면 phosphatase inhibitor 없이 lysis buffer (RIPA) 넣고 분해 후 brad ford로 농도를 잡고 20ul씩 page-western 진행 해도 될까요?   IKK activation -> IKB phosphorylation (+ubiquitination) 가 되어서 IKB는 proteasome에 의해서 제거가 될거고... NF-KB는 IKB와 떨어져  유리 상태이니 1번 처럼 진행해도 되는지 궁금합니다.    2. 반대로 IKB의 농도를 보고 싶으면 phosphatase inhibitor와 lysis buffer 을 넣고 실험을 진행하면 될까요? IKK의 역할이 안될테니..  IKB-NFKB complex 상태로 gel에서 확인이 되는지 궁금합니다.
회원작성글 수서  |  2019.10.02
Q. RBC lysis가 잘 되지 않는 이유가 뭔지 궁금합니다.
Conical에 전혈과 CANCER CELL을 넣고 Lysis를 하면 cancer cell이 잘 보이는반면에, 150~1500rpm까지 순차적으로 centrifugation 된 RBC (혈장포함)를 회수한 후 lysis를 하면 cancer cell이 잘 보이지 않습니다.     첫번째 줄이 conical에 전혈과 cancer cell을 lysis한 상태이며 두번째 줄이 conical이 아닌 다른 물품을 이용해 centrifugation한 후 다시 회수하여 lysis한 상태입니다.   제가 생각하는 원인은 centrifugation을 통해 rbc들끼리 한번 뭉쳐지고 나서 lysis를 하는거라 vortex를 진행하여도 완전히 붙은 rbc들이 떨어지지 않고 뭉쳐있어서 lysis가 잘 되지 않는건가 생각되는데...잘 아시는분들 계시면 알려주시면 감사하겠습니다. (제가 하는 실험에서 혈액분리가 중요해서 centrifugation 과정 후 lysis를 하게 됩니다. rbc에 떨어져있는 cell이 있는지 확인과정이 필요하기 때문에 RBC를 회수하여 lysis를 진행합니다. )
회원작성글 빈이222  |  2019.09.25
Q. 효소 실험 후 정리 방법
 셀룰라아제 효소로 셀룰로오스 분해 실험을 하는데, 선행 연구에서 농도나 온도 설정에 대해서는 나와있어서 그걸 참고할 수 있었는데, 실험 완료 후의 처리에 대해서는 자세히 안나와있어서 곤란하네요.  실험 완료 후에 따로 취해야할 조치가 있나요? (효소 분해 반응을 종료시킬 때 필요한 것이나, 폐액 처리에 대해서)
회원작성글 10SEVEN  |  2019.09.21
Q. Cell extraction에 관해 질문있습니다.
cell을 SDS sample buffer로 harvest하기 전에 media 제거 후 wash를 생략해버렸는데, wash에 따라 결과가 달라진 적이 있는지 궁금합니다.
회원작성글 대연  |  2019.09.18
Q. 분명 같은 sample로 진행하는데 western이나 pcr 결과가 조금씩 다르게 나오는건 왜일까요?
안녕하세요 석사과정 학생입니다. 제목 그대로 분명 같은 sample을 사용하는 (같은 방식으로 2번 진행한 것이 아니라 아예 같은 batch입니다) pcr이나 western 실험에서 경향이 조금씩 다르게 나옵니다.    저같은 경우에는 비슷한 성질을 가진 물질을 a~d까지 처리하는데 분명 a~d까지 모두 control 대비 원하는 marker 발현이 증가하지만 그 경향이 조금씩 다르고, 발현 증가 정도도 조금씩 다릅니다.   이를테면 n번째 웨스턴에서는 control대비 a처리군의 발현이 약 1.3배 증가했는데 m번째 웨스턴에서는 1.8배 증가하는 식으로요.   pcr은 워낙 미량을 사용하다보니 작은 차이도 결과적으로는 큰 차이가 나는 것 같습니다.   물론 아직 제 손이 미숙한 것이 이유겠지만 western의 경우에는 loading하는 양도 대게 20~30ul정도로 적은 편은 아니고 antibody도 늘 같은걸 사용한데 발현양에 차이가 나는 이유가 궁금합니다. 어떤 요인 때문일까요?
회원작성글 진저브래드트윅스  |  2019.08.28
Q. 10X RIPA buffer의 침전물이 녹지 않습니다. 원인이 무엇인지 궁금합니다.
cell 공부를 하고 있는 학부생입니다. 이번에 저희 실험실에서 세포를 처음 다루게 되었습니다. 그로인해 Lysis buffer가 필요하여 Cell signaling 사의 #9806 10X RIPA buffer를 구입하였습니다. 문제는 냉동상태의 버퍼를 용해하였는데 침전물이 꽤 많이 생겨있는것입니다. 그래서 RIPA buffer의 조성에 SDS가 포함되어 있으므로 그에 따른 침전물이라 생각하고 37C water bath에 방치하였는데 2시간이 지나도 침전물이 용해되지 않습니다. ㅠㅠ 여기서 궁금증이 발생하였습니다. 1. 이 침전물은 SDS가 아닌 다른 물질일까요?? 2. 혹은 이 제품자체가 불량 제품일 확률이 있을까요???
회원작성글 apple693  |  2019.08.13
Q. MTT assay 질문합니다
랩마다 프로토콜이 다르겠지만.. MTT assay에서 농도별 시료를 처리한 뒤 incubation을 4시간정도 시켜줬는데요 그다음 2000ppm의 MTT formazan을 처리해주는데 그 전에 상층액을 suction하고 pbs로 세척해주어야 하나요? 이번에 처음 해보는 assay인대 프로토콜에는 상층액 제거 이야기가 없어서 혹시 몰라 질문드립니다.. 그리고 RAW 264.7 cell로 mtt를 진행하기도 하나요?
회원작성글 RBR  |  2019.07.28
Q. RIPA buffer사용했는데 pellet이 젤리같아요.
RIPA로 DP cell lysis시키고 centrifuge 했는데 pellet이 절리처럼 만들어져요. 몇번 해봤는데 똑같이 젤리처럼 떠요, pellet을 pipet으로 제거해보긴 하는데 좀 찜찜하고 깨끗하지가 않아요. 이거 왜 이런건지, 해결방법 아시는 분 계신가요?
회원작성글 오곡의힘  |  2019.07.16
Q. Edta와디소듐이디테이
제가 아는 바에 의하면 edta는 세포벽을 파괴한다고 알고 있는데요.. 그러면 edta또는 디소듐이디티에는 미생물 증식 억제 효과도 있을까요?
회원작성글 아니대체왜  |  2019.07.08
Q. 아넥신
아넥신 찍을때 binding buffer를 쓰잖아요 그런데 제가 일주일 전에 쓰고 남은 바인딩 버퍼를 4도씨에 보관해두렀는데 써도 괜찮을까요? 이미 1X로 희석을 한 버퍼입니다!
회원작성글 나다니95  |  2019.06.26
Q. Buffer 관련 질문입니다.
현재 WBC 분리 실험을 하는데 밀도에 따른 분류를 하고 있어서 buffer에 대한 고민이 큽니다ㅠㅠㅠ   WBC가 잘 살아남으면서(PBS같이) 분리가 진행됨에 따라 세포를 밀도에 따라 구분 지을수 있는 그런 buffer가 있다면 알려주세요
회원작성글 영빙구  |  2019.06.10
Q. cell lysate stock
모유두세포로 5alpha reductase inhibition assay를 하려고 합니다. 전 실험에서는 한번 lysis하고 당일 실험하고 버렸는데, 이제 결과 제대로 낼려고 stock해놓고 실험하려고 합니다. stock할때 glycerol을 넣는다고 하는데, 얼마나 넣어야 할지 잘 모르겠어서요. 그리고 reductase가 해동시켰을때 안정할까요?  잘 아시는분 답변부탁드립니다!!
회원작성글 grapefruit..  |  2019.06.01
Q. BSA희석
BSA를 희석하려고 하는데요 증류수에 녹이나요? 1mg/ml stock농도를 맞추려 하는데 어떻게 희석해야 하나요 ㅠㅅㅠ
회원작성글 나다니95  |  2019.05.30
Q. Cell lysis 확인법에 대한 질문입니다.
지금 현재 cell을 reagent나 sonication 등등을 이용하여 lysis를 진행해보았는데 현재 실험하고자 하는게 chemical적인 lysis가 아니라 mechanical하게 lysis를 진행하는거에요 그러다 보니 다른 방법에 비해 lysis가 잘되었다 안되었다라고 판단이 될만한 지표가 필요한데 혹시 아시는 분있으시면 알려주세요~   protein, DNA quantification이나 tryphan blue염색, WB, DNA 전기영동 등등 생각은하는데 생각보다 잘 안떠오르네요ㅠㅠㅠ
회원작성글 영빙구  |  2019.05.28
Q. Flow cytometry compensation control 잡는거 도와주세요 첨부파일
안녕하세요, Flow cytometry 측정시 compensation control 잡는데 어려움을 겪고 있어 도움 요청드립니다ㅠ   사용하고 있는 프로그램은 cellquest pro 이고, 샘플은 adherent cancer cell line 입니다.   voltage 조정 후 compensation 을 맞추려 하는데, FITC만 stain한 세번째 그림을 보시면 2사분면에 많이 가 있습니다. 이를 3,4사분면(아래쪽)으로 맞추면 PI만 스테이닝 한것이 보이지 않고, PI가 보이게 맞추면, FITC가 보시는 바와 같이 위쪽으로 올라가게 됩니다.   조언 부탁드리겠습니다ㅠㅠ 감사합니다!!!  
회원작성글 syyoon0504  |  2019.05.27
Q. Adherent cell line 이용한 FACS 분석 도와주세요ㅠ 첨부파일
안녕하세요, Adherent cell line의 apoptosis를 보기위해 FACS (Annexin V-PI)를 찍었는데, 결과에 대한 조언 부탁드립니다. 질문1) 오른쪽 FL1-H/FL2H dot plot을 보시면 두개의 population이 있는 것 처럼 보이는데, 하나의 indicator로 보아도 무방할지, 아니면 두개의 다른 population으로 보는것이 나을까요?  왼쪽 plot에 하이라이트 한 부분을 gate치면 오른쪽 plot에 하이라이트 한 부분이 사라집니다.  질문2) 샘플측정 후 분석시에 linear/log 스케일 변환이 가능한가요? 사용하고 있는 기계는 BD FacsCalibur이고, 맥에서 CallQuest 프로그램 사용합니다.   감사합니다!!
회원작성글 syyoon0504  |  2019.05.14
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