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웹진 Vol.24, No.10 (2022년 10월) 발간
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 카테고리: 전체 > Immunology > etc.
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Q. Ovalbumin 기관지천식유도
안녕하세요! 제가 실험실초보여서 제발 답변부탁드립니다. 기관지 천식을 Balb/c 마우스에 유도하려하는데요 ovalbumin,Aluminum potassium sulfate,PBS 를 이용하여 용액을 만들고자 합니다. 물질이 잘녹지않아서.. 고민이 많습니다. 실험해보신분있으시다면 답변 꼭 부탁드립니다. 감사합니다!!
회원작성글 봉구뱅  |  2020.11.13
프로토콜 [연재][후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트] #6_EAE 연구 활용법
* 본 글은 "BRIC Bio통신원의 연재"에 올려진 동일한 제목의 컨텐츠를 "프로토콜"에서도 소개하기 위해 동일한 내용으로 올렸습니다(클릭시 연재글로 이동).     이전 연재글을 통해 자가면역질활 중 다발성 경화증(Multiple sclerosis)의 마우스 질병 모델인 EAE(Experimental autoimmune encephalomyelitis)에 대한 개념을 소개하였습니다. 이번 글에서는 해당 모델을 통해 얻을 수 있는 데이터들은 어떤 것들이 있으며 이를 통해 어떤 연구들이 가능한지 소개하도록 하겠습니다.   1. EAE clinical scoring EAE를 유도하면 중추신경계에서 염증이 발생하고 이로 인해 신경세포의 Demyelination이 일어나게 됩니다. 이러한 염증 및 조직의 손상을 측정하는 것도 중요한 데이터이지만, 이러한 현상을 보기에 앞서 밖으로 드러나는 병리학적 증상들을 우선적으로 관찰하는 것이 일반적입니다. 물론 설명한대로 염증으로 인한 Demyelination이 원인이지만, 이로 인해 결과적으로 운동능력의 상실 및 마비가 일어나게 되는데 이런 병리학적 증상들은 단계적으로 발생하며, 이러한 단계별 증상에 점수를 부여함으로써 질병의 정도를 수치화할 수 있습니다 (그림 1). 특정 유전자가 결손되었거나 특정 치료약물을 처리한 실험그룹과 대조그룹 간의 질병이 나타난 시기를 비교하거나 점수를 비교함으로써 해당 유전자 혹은 해당 약물이 EAE 발병 및 악화에 미치는 영향을 알 수 있습니다. 추가적으로 질병이 악화됨에 따라 몸무게의 감소도 동반되기 때문에 체중의 변화도 하나의 데이터로 사용될 수 있습니다. 보통 증상이 가시적으로 나타나기에 앞서 체중의 감소가 먼저 나타가기 때문에 체중 감소를 질병의 전조증상으로도 볼 수 있습니다. EAE를 유도한 후 10~14일정도 지나면 마우스의 꼬리부터 마비가 나타납니다. 시간이 경과함에 따라 꼬리뿐만 아니라 뒷다리의 움직임도 둔해지고 결과적으로는 뒷다리를 전혀 움직이지 못하고 앞다리 힘도 줄어드는 상태까지 증상이 심해지게됩니다. 증상에 따라 단계별로 부여하는 점수는 실험실마다 조금씩 차이는 있습니다. 제가 속한 실험실에서는 다음 기준에 따라 점수를 차등 부여하고 있습니다. 유의할 점은 점수에 따라 기재된 증상은 이전 증상에 추가적으로 나타나는 증상이지 이전 증상이 사라지고 새로운 증상이 나타나는 것이 아니라는 점입니다. 0: 무증상 0.5: 꼬리 끝 부분이 마비된다. 1.0: 꼬리 전체가 마비된다. 1.5: 케이지(cage)를 덮는 스테인레스 탑 (stainless top)에 마우스를 놓고 걷게 했을 때 간헐적으로 한쪽 뒷다리가 아래로 떨어진다. 2.0: 꼬리를 잡고 마우스를 거꾸로 들었을 때 뒷다리가 바깥으로 쭉 펼쳐지지 않는다. 2.5: 스테인레스 탑을 걷게 했을 때 마우스의 뒷다리가 아래로 계속 떨어지지만 다리를 겨우 끌어올릴 수 있다. 3.0: 스테인레스 탑을 걷게 했을 때 떨어진 뒷다리를 끌어올리지 못하고 발이 떨리기만 한다. 3.5: 뒷다리가 완전히 마비되어 전혀 움직이지 않는다. 4.0: 앞다리의 힘이 빠져서 스테인레스 탑을 붙잡지 못한다. 4.5: 죽거나 극심한 체중 감소(30% 감소)로 인한 안락사가 불가피하다. 증상이 처음 나타난 후 보통 4일정도 지나면 3.5 ~ 4.0점 정도의 심한 증상을 관찰할 수 있습니다. 며칠 더 지나면 염증을 억제하는 기능을 하는 Treg cell로 인해서 1.0 ~ 2.0점 정도로 증상이 일부 호전되기도 하지만, 완벽한 회복은 일어나지 않고 다시 증상이 나빠지게 되는 경우도 생깁니다.   2. Passive EAE Scoring 앞서 설명한 EAE의 증상들은 MOG peptide를 이용한 Active EAE의 경우 나타나는 증상들입니다. 하지만 Rag KO mouse나 Tcra KO mouse 등 T cell이 없는 마우스를 Recipient mouse로 이용하여 in vitro 배양한 2D2 Th1 cell 혹은 2D2 pathogenic Th17 (pTh17) cell을 Adoptive transfer하여 유도한 Passive EAE의 경우 조금 다른 증상들을 보입니다. 1) 증상이 최고점에 다다른 후에 회복이 일어나지 않습니다. Active EAE의 경우 시간이 지나면 증상이 일부 나아지는 경향을 관찰할 수 있지만, T cell이 결필된 Recipient mouse를 이용한 Passive EAE의 경우 Treg cell이 없기 때문에 강한 염증이 지속적으로 발생하고, 이로인해서 증상이 호전되지 않습니다. 2) pTh17 cell로 유도된 Passive EAE의 경우 절반정도의 마우스에서 Active EAE에서 보이지 않는 증상들을 관찰할 수 있는데, 이를 연구한 논문에서는 이를 Non-classical EAE 또는 Atypical EAE로 명명합니다 (Domingues et al., 2010). 보통 EAE에서 처음 발견되는 증상은 꼬리의 마비인 것과는 달리 Atypical EAE에서는 보행능력의 상실이 먼저 관찰됩니다. 이와 관련하여 해당 논문에서는 다음과 같이 점수를 부여합니다. 0: 무증상 1: 머리가 살짝 돌아간다 (꼬리 마비 없음). 2: 머리가 확연하게 돌아간다. 3: 똑바로 직진하지 못한다. 4: 옆으로 눕는다. 4.5: 앞으로 나아가지 못하고 제자리에서 빙글빙글 돈다. 5: 죽거나 안락사 해야할 시점이다. 이를 근거로 하여 제가 속한 랩에서는 다음과 같이 조금 더 구체화하여 점수를 부여하고 있습니다. 0: 무증상 1: 머리가 살짝 돌아간다 (꼬리 마비 없음). 또는 마우스를 꼬리를 잡고 거꾸로 들었을 때 한 쪽 다리를 바깥쪽으로 펴지 못한다. 2: 머리가 확연하게 돌아간다. 또는 케이지(cage)를 덮는 스테인레스 탑 (stainless top)에 마우스를 놓고 걷게 했을 때 간헐적으로 한쪽 뒷다리가 아래로 떨어진다. 2.5: 마우스를 꼬리를 잡고 거꾸로 들었을 때 양쪽 뒷다리를 바깥쪽으로 펴지 못한다. 3.0: 똑바로 직진하지 못한다. 또는 한 쪽 뒷다리가 마비되어 움직이지 못한다. 3.5: 옆으로 눞는다. 또는 뒷다리가 모두 완전히 마비되어 움직이지 못한다. 4.0: 옆으로 누워서 앞으로 나아가지 못하고 제자리에서 빙글빙글 돈다. 4.5: 죽거나 안락사 해야할 시점이다.   3. 조직 및 면역세포 분석 앞서 본 Clinical scoring은 염증으로 인해 발생한 병리학적 증상들을 데이터화한 것입니다. 두 그룹간 점수 혹은 발병시기에 차이가 있다면, 그 원인은 궁극적으로 마우스 내부에서 일어난 면역학적 현상 및 염증으로 인한 조직 손상의 차이에서 찾을 수 있을 것입니다. 면역반응이 시작되는 곳은 Lymph node이며 염증이 발생하는 곳은 Spinal cord이기 때문에 일반적으로 이 두 곳에서 얻는 면역세포들을 주로 분석합니다. 참고로 Injection site에 근접한 draining lymph node는 Inguinal lymph node입니다. 물론 원하는 목적에 따라 혈액, 장, 폐 등 다른 기관들에 있는 면역세포들을 분석 할 수 있습니다. 어떤 연구기법들을 통해 EAE의 발병 기전을 연구할 수 있는지 소개하도록 하겠습니다. 1) Flow cytometry 면역학 연구에서 빠질 수 없는 Flow cytometry 분석을 이용하여 면역세포의 조성을 비교할 수 있습니다. 예를 들어 EAE의 원인이 되는 CD4 T cell의 분화정도 및 CD4 T cell이 만들어내는 Cytokine의 종류를 Flow cytometry를 통해 비교분석 할 수 있습니다. 또한 Flow cytometry를 이용하여 특정 면역세포의 비율을 구함으로써 Spinal cord에 존재하는 Neutrophil, Inflammatory monocytes, γδ T cells 등 다양한 면역세포의 수를 비교할 수도 있습니다. Spinal cord로 부터 면역세포를 얻기 위해서는 보통 Collagenase D를 사용하여 조직의 Extracelluar matrix를 분해하는 과정이 필요합니다. Collagenase D는 세포막단백질에 영향을 거의 주지 않는 것으로 알려져있으나, 연구자 본인이 연구하는 세포막단백질이 혹시라도 Collagenase D에 의해 영향을 받는다면 이 부분을 고려해야할 것입니다. 또한 Spinal cord는 상당히 많은 양의 지질을 갖고 있기 때문에 Percoll gradient를 이용한 원심분리를 통해 지질층을 제거하는 과정이 필요합니다. 2) Immunohistochemistry Flow cytometry를 이용해 Lymph node에서 면역 세포의 분화 및 Spinal cord로의 면역세포의 이동을 비교분석하는 것 뿐만 아니라 Spinal cord의 조직 단면 자체를 관찰하는 것을 통해 Demyelination 정도나 특정 면역세포의 조직내로의 침윤 정도 및 위치 등을 비교할 수 있습니다 (그림 2). 면역세포들이 Spinal cord로 이동할 때 Lumbar 5 쪽에서부터 침투가 시작되기 때문에(Arima et al., 2012) Lumbar 5 부분으로부터 얻은 Section을 주로 활용합니다. 3) Two-photon microscopy Two-photon microscopy는 생체 내에서 면역세포의 이동을 실시간으로 측정할 수 있는 기법이기 때문에 면역세포의 이동을 연구하거나 다른 면역세포들과의 상호작용을 실시간으로 분석하는 등의 목적에 따라 EAE 연구에 사용될 수 있습니다 (Bartholomaus et al., 2009) (그림 3). 하지만 실험의 특성상 해당 기법을 셋업하고 익히기까지 드는 시간적/경제적 비용이 상대적으로 크다는 단점이 있습니다. Two-photon microscopy를 이용해 살아있는 생체 내에서 뿐 아니라 분리해낸 Spinal cord 전체를 스캔하여 Spinal cord내 특정 면역세포의 분포를 확인할 수도 있습니다 (Othy et al., 2020) (그림 4).     4) Single-cell analysis: Immune cell heterogeneity 연구 면역세포는 사실 우리가 분류하는 기준 이상으로 다양성(Heterogeneity)을 가집니다. 예를 들어 IL-17A를 발현하는 CD4 T cell을 통상적으로 Th17 cell이라고 부르지만, 그 안을 더 자세히 들여다보면 IFN-γ, GM-CSF, TNF-α 등등 다른 Cytokine을 동시에 발현하는 Th17 cell이 존재합니다. Th17 cell을 예로 들었지만, 면역세포의 Heterogeneity는 T cell 뿐만 아니라 Myeloid lineage cell에서도 상당히 많이 관찰되고 연구되고 있습니다. 이러한 Immune cell heterogeneity는 면역세포의 초기 발생과정에서도 결정되지만, 염증상황이 만들어내는 환경에 의해 발생하기도 합니다. 따라서 자가면역질환 환자에게서 유독 특정 면역세포가 많이 발견되기도 있습니다. 이러한 Immune cell heterogeneity를 연구하는데 있어서 Single-cell RNAseq이 널리 이용됩니다. 이런 부분에 착안하여 EAE를 유도한 마우스에서 얻은 면역세포를 Single-cell RNAseq 기법으로 분석하여 EAE, 더 나아가 Multiple sclerosis 발병과정에서 면역세포가 어떻게 다양하게 구성되고 어떤 유전자가 특정 면역세포의 발달에 기여하는지를 연구할 수 있습니다 (Gaublomme et al., 2015; Wheeler et al., 2020)   4. EAE 연구 Tip EAE를 이용한 연구를 함에 있어서 실질적으로 도움이 될만한 내용들을 소개합니다. 1) Gut microbiota에 대한 이해 다른 많은 In vivo 실험들이 그렇듯이, EAE 역시 실험 간에 존재하는 다양한 변수들로 인해 실험을 할 때마다 결과가 조금씩 다르게 나옵니다. 어떤 때는 발병이 빠르고, 또 어떤 때는 발병이 더디기도 합니다. 물론 여러가지 변수들이 있습니다. 가장 먼저는 실험을 할 때마다 생기는 시약들(MOG peptide, CFA, Pertussis toxin)의 양 및 안정성(Stability)의 차이가 생깁니다. 하지만 이것 말고도 존재하는 변수가 있는데 마우스의 장내 세균총(Gut microbiota)의 차이입니다. 장에 서식하는 다양한 세균들은 면역반응은 직간접적으로 상당부분 기여합니다. 예를 들어 Germ-free 마우스의 경우 EAE가 잘 유도되지 않고 유도되더라도 Clinical score가 낮습니다. SFB라는 박테리아는 마우스의 장에서 Th17 cell의 분화를 유도하는 것으로 알려져있는데, 이 박테리아는 EAE발병에 관여합니다(Lee et al., 2011). 또한 박테리아가 만드는 Short chain fatty acid는 Treg cell 분화에 관여합니다(Smith et al., 2013). 흥미롭게도 최근 Nature에 발표된 연구에 따르면 Lactobacillus reuteri라는 세균은 MOG와 유사한 단백질을 만들고 이로인해 MOG-specific Th17 cell 분화에 기여하기도 합니다(Miyauchi et al., 2020). 이처럼 다양한 장내세균이 EAE 유도에 영향을 줍니다. 따라서 비교할 그룹의 마우스들을 같은 케이지에서 키움으로써 장내세균총을 유사하게하는 것이 EAE에 영향을 주는 변수를 줄이는 하나의 방법이 될 수 있습니다. 같은 이유로 동물실에 따라 EAE의 발병정도에 차이가 생길 수 있기 때문에 만약 EAE가 유도되지 않는다면 동물실을 옮겨보는 것도 하나의 해결방법이 됩니다. 제가 속한 연구실의 경우 마우스를 관리하는 동물실을 변경했더니 갑자기 EAE가 유도되지 않아 애를 먹었고, 다시 다른 동물실로 동물을 옮기니 EAE가 다시 유도되는 미스테리한 일을 경험했습니다. 2) Spinal cord harvest : meninge가 섞이는 것 주의 Spinal cord를 분리하는 방법은 크게 두 가지 입니다. 한 가지는 척추뼈의 양 말단을 자른 후 한 쪽에 PBS를 주사기로 강하게 밀어넣어 척수가 반대편에서 밀려 나오도록 하는 방법입니다. 다른 방법은 척추뼈를 뜯어내고 그 안에 있는 척수를 집어내어 분리하는 방법입니다. 그런데 이러한 방법의 차이가 분석될 샘플의 차이를 만들어냅니다. 주사기를 이용해 Spinal cord를 분리한 후 척추뼈를 뜯어보면, 뼈 내부에 Spinal cord meninge가 붙어 남아있는 것을 확인할 수 있습니다. 즉, 주사기를 이용해서 Spinal cord를 분리할 때는 Spinal cord meninge를 제외한 Parenchyma 부분이 분리되는 것입니다. 물론 Meninge와 Parenchyma가 완벽히 분리된다고 보기에는 어려울 것이고 Meninge의 일부도 딸려 나올 것이라고 여겨지지만, 주사기로 밀어내 분리한 Spinal cord parenchyma와 뼈 내부에 붙어있는 Meninge를 비교분석해보면 안에 존재하는 면역세포의 조성이 다르다는 것을 알 수 있습니다 (그림. 5). 그리고 그림. 5에 해당하는 CD4 T cell을 더 분석해보면 그 안에 존재하는 Subset의 비율도 다릅니다. 게다가 Meninge에 있는 면역세포의 숫자도 결코 무시할 수준이 아니고, 이 정도는 EAE의 발병 단계에 따라서도 많이 차이가 납니다. 이런 이유로 Meninge가 섞이도록 Spinal cord를 분리할 경우 분석에 오류가 발생할 수 있습니다. 따라서 척추뼈를 뜯어서 Spinal cord를 분리하는 방법은 샘플에 Meninge라는 변수를 추가하게 될 가능성이 높기 때문에 추천하지 않는 방법입니다. 보통 주사기를 이용해 밀어내는 방법이 아직 익숙하지 않을 때 몇번 시도했으나 Spinal cord가 나오지 않아서 차선책으로 뼈를 뜯어내는 경우가 생깁니다. 이러한 경우 Meninge가 샘플에 딸려오지 않도록 주의하는 것이 실험의 정확도를 높이는 방법입니다. 이를 위해서 척추 뼈 내에 어떤 부분이 Meninge인지 미리 알아두는 것이 도움이 됩니다.   3) Scoring의 일관성 유지 EAE를 유도한 후 관찰되는 증상들에 대한 Scoring의 경우 비교적 직관전인 가이드라인이 존재하지만, 어찌되었든 사람에 따라 주관적으로 판단하게 될 소지가 충분히 있습니다. 따라서 Scoring의 경우 한 명의 연구자가 일관성있게 지속적으로 하는 것이 필요합니다. 물론 주말을 포함해 매일 동물실에 가서 Scoring을 하기가 쉽지는 않지만 좋은 데이터를 얻기위해서 필요한 하나의 과정입니다. Scoring을 하는 시간대도 중요합니다. EAE로 인한 증상이 이제 막 시작되는 경우에는 짧은 시간 안에 증상이 급격하게 나빠지는 경우들이 있습니다. 예를 들어 오전에는 증상이 없었는데 오후가 되어서 증상이 보이거나 오전에는 Score가 낮았는데 오후가 되니 더 높은 Score에 해당하는 증상들을 보이는 경우입니다. 이러한 이유로 매일 같은 시간대에 마우스를 관찰하는 것이 변수를 줄이고 일관성을 유지하는 방법입니다. 4) Emulsification의 일관성 유지 EAE 유도는 MOG peptide와 CFA를 섞어주는 Emulsification에서 시작됩니다. 보통 MOG peptide가 섞인 PBS와 CFA를 1:1 비율로 섞어주는데, 문제는 CFA가 점성이 높아서 파이펫을 이용해 정량할 때 오차가 발생하기 쉽다는 점입니다. 또한 두 개의 Glass syringe를 연결하는 과정에서 CFA를 흘리는 실수가 발생해서 CFA의 부피가 줄기도 합니다. 이러한 정량과정에서의 오차는 결국 EAE로 인한 면역반응의 강도에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 늘 일관성있게 부피를 정량하는 것이 실험간의 변수를 줄이는 방법입니다. 추가적으로 양 손에 Glass syringe를 쥐고 Emulsification을 하다보면 손바닥으로 Syringe를 움켜쥐기도합니다. 그런데 이렇게 Syringe를 움켜잡을 경우 체온에 의해 Emulsion의 온도가 올라갑니다. 이렇게 상승된 온도는 MOG peptide의 안정성에 영향을 줄 수도 있습니다. 물론 이정도 온도상승과 짧은 노출 시간이 엄청나게 큰 영향을 주지는 않겠지만, Emulsification 과정과 시간을 일관성 있게 유지하는 것도 일관성 있는 데이터를 얻는데 도움이 될 것입니다.   5. 마치는 글 이번 연재를 통해서는 EAE를 통해 얻을 수 있는 데이터의 종류와 EAE를 이용한 연구에 실질적으로 도움이 될만한 정보들을 소개했습니다. EAE를 이용한 연구를 하지 않는 분들께는 다소 생소한 내용일 수 있으나, 실제적으로 EAE를 이용한 연구를 하고있는 연구자분들께 조금이나마 도움이 되었기를 바라며 이번 글을 마무리 짓겠습니다.   References Arima, Y., Harada, M., Kamimura, D., Park, J.H., Kawano, F., Yull, F.E., Kawamoto, T., Iwakura, Y., Betz, U.A., Marquez, G., et al. (2012). Regional neural activation defines a gateway for autoreactive T cells to cross the blood-brain barrier. Cell 148, 447-457. Bartholomaus, I., Kawakami, N., Odoardi, F., Schlager, C., Miljkovic, D., Ellwart, J.W., Klinkert, W.E., Flugel-Koch, C., Issekutz, T.B., Wekerle, H., et al. (2009). Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature 462, 94-98. Domingues, H.S., Mues, M., Lassmann, H., Wekerle, H., and Krishnamoorthy, G. (2010). Functional and pathogenic differences of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. PLoS One 5, e15531. Gaublomme, J.T., Yosef, N., Lee, Y., Gertner, R.S., Yang, L.V., Wu, C., Pandolfi, P.P., Mak, T., Satija, R., Shalek, A.K., et al. (2015). Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell 163, 1400-1412. Lee, Y.K., Menezes, J.S., Umesaki, Y., and Mazmanian, S.K. (2011). Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A 108 Suppl 1, 4615-4622. Miyauchi, E., Kim, S.W., Suda, W., Kawasumi, M., Onawa, S., Taguchi-Atarashi, N., Morita, H., Taylor, T.D., Hattori, M., and Ohno, H. (2020). Gut microorganisms act together to exacerbate inflammation in spinal cords. Nature 585, 102-106. Othy, S., Jairaman, A., Dynes, J.L., Dong, T.X., Tune, C., Yeromin, A.V., Zavala, A., Akunwafo, C., Chen, F., Parker, I., et al. (2020). Regulatory T cells suppress Th17 cell Ca(2+) signaling in the spinal cord during murine autoimmune neuroinflammation. Proc Natl Acad Sci U S A 117, 20088-20099. Smith, P.M., Howitt, M.R., Panikov, N., Michaud, M., Gallini, C.A., Bohlooly, Y.M., Glickman, J.N., and Garrett, W.S. (2013). The microbial metabolites, short-chain fatty acids, regulate colonic Treg cell homeostasis. Science 341, 569-573. Wheeler, M.A., Clark, I.C., Tjon, E.C., Li, Z., Zandee, S.E.J., Couturier, C.P., Watson, B.R., Scalisi, G., Alkwai, S., Rothhammer, V., et al. (2020). MAFG-driven astrocytes promote CNS inflammation. Nature 578, 593-599.      
박은총  |  2020.11.06
Q. 디스크 확산법의 배지 관련하여 질문드립니다!!
대장균과 황색포도상구균으로 디스크 확산법 실험을 진행할 계획입니다. 표준 한천배지 (PCA) TSA Media Plate 보통 한천배지 LB Agar plate (Ampicillin을 넣은 배지) 중 어느 것을 사용해야 할까요?
회원작성글 Yell  |  2020.10.27
Q. 항생제 감수성 디스크 실험 관련하여 질문드립니다.
지금 마늘의 항균작용을 확인하는 실험을 하고 있는데, 세균을 몇배정도 희석하여 사용해야 할까요? 세균은 생물나라라는 사이트에서 황색포도상구균과 대장균을 구입하였습니다.
회원작성글 Yell  |  2020.10.26
Q. murine apoptotic thymocyte를 대체할 수 있는 human cell이 있을까요?
선배님들 안녕하십니까, 최근 논문에서 murine thymocyte에 dexamethasone을 처리하여 apoptotic cell로 만든 뒤에 macrophage의 efferocytosis를 보는 논문이 있었습니다. 저는 human macrophage를 이용해서 efferocytosis를 보고 싶은데요. 저 apoptotic cell을 human macrophage 용으로 만드는 게 까다로운 거 같습니다. 1. murine thymocyte를 이용해서 위의 실험을 해도 괜찮을까요? (mouse apoptotic cell + human macrophage) 2. 만약 human cell로 대체해야 한다면 위의 thymocyte를 대체할만한 cell line이나 방법이 있을까요? (human apoptotic cell (어떤 cell?) + human amcrophage)
회원작성글 방탕소년  |  2020.10.26
Q. Bone marrow derived macrophage(BMDM)에서 LPS stimulation 관련 질문입니다
  안녕하세요 Bone marrow derived macrophage(BMDM)에서 LPS stimulation에서 특정 material을 LPS와 cotreat 한 경우 cytokine양의 감소관련 실험을 진행하고 있습니다. 여기에서 물어보고 싶은 것이 있습니다. 기본적으로 BMDM을 키울때에는 mouse에서 BMC를 마리당 100mm dish에 complete media(10%FBS+alpha-MEM+1%Abx) 4h~O.N. incubation해서 macrophage progenitor이외의 부착성 cell들을 붙이고 그중에 sup에 떠있는 cell들을 걷어서 위의 complete media에 M-CSF를 treat한 후 3d culture 합니다. 그렇게 자란 BMDM을 lifter로 긁어내어 1x10^6cells/ml로 complete media에 resuspension한 후 24well plate에 well당 500ml씩 분주하고 O.N. incubation 하여 cell을 seeding 합니다. Macrophage가 붙은 것을 확인한 후 serum free media로 washing해준 후 위의 complete media를 넣고 LPS그리고 material을 넣고 진행을 합니다. 그런데 보통 LPS stimulation을 줄 때 FBS를 넣으면 안되거나 5%정도로 비교적 소량을 넣어야 하나요? 그렇다면 그 이유는 무엇인가요?? 그리고 혹시 LPS stimulation을 줄때 alpha-MEM을 사용하면 안되는 건가요?? 배지의 차이가 클 수도 있을까요??
회원작성글 ㅡ,ㅡ;;  |  2020.10.26
Q. BMDM에서 LPS stimulation 관련 질문입니다
안녕하세요 BMDM에서 LPS stimulation에서 특정 material을 LPS와 cotreat 한 경우 cytokine양의 감소관련 실험을 진행하고 있습니다. 여기에서 물어보고 싶은 것이 있습니다. 기본적으로 BMDM을 키울때에는 mouse에서 BMC를 마리당 100mm dish에 complete media(10%FBS+alpha-MEM+1%Abx) 4h~O.N. incubation해서 macrophage progenitor이외의 부착성 cell들을 붙이고 그중에 sup에 떠있는 cell들을 걷어서 위의 complete media에 M-CSF를 treat한 후 3d culture 합니다. 그렇게 자란 BMDM을 lifter로 긁어내어 1x10^6cells/ml로 complete media에 resuspension한 후 24well plate에 well당 500ml씩 분주하고 O.N. incubation 하여 cell을 seeding 합니다. Macrophage가 붙은 것을 확인한 후 serum free media로 washing해준 후 위의 complete media를 넣고 LPS그리고 material을 넣고 진행을 합니다. 그런데 보통 LPS stimulation을 줄 때 FBS를 넣으면 안되거나 5%정도로 비교적 소량을 넣어야 하나요? 그렇다면 그 이유는 무엇인가요??
회원작성글 ㅡ,ㅡ;;  |  2020.10.22
Q. CTl activation
안녕하세요 Tcell activation 하려는 대학원 생입니다 여러번 실패하니 죽을 맛이네요 각설하고 저희 랩 프로토콜 에서는 5x10e6cell/well로 cd3 cd28이 코팅된 6well plate에서 activation 을 하는데 제가 하면 자꾸 셀이 죽는 것 같아서 질문 합니다 어느 정도 셀의 양이 있어야 할까요??
회원작성글 힘들어,,,  |  2020.10.18
Q. Beta-hexosaminidase 방출 측정 실험을 하려고 합니다.
특정 시료가 알러지를 유발하는지를 알아보기 위해 Beta-hexosaminidase 방출 측정 실험을 진행하려고 합니다. 실험 과정으로  1. RBL-2H3을 seeding하고 배양한 다음 Anti-DNP IgE(Sigma)가 들어간 media를 처리 해준다. 2. IgE media를 제거하고 시료가 들어간 농도별 sample media를 분주해 준 다음 배양한다. 3. 상층액과 Beta hexosaminidase Activity assay kit(CELL BIOLABS)를 사용 하여 측정한다. 이렇게 과정을 짰는데, 저희 실험실에서는 알러지 관련 실험을 이전에 해 본 적이 없고 제가 처음이라 알아보고 방법을 짜볼려고 하는데 이렇게 해도 될지 고쳐야 할 부분이 있는지 조언을 구하고자 질문 올립니다.  
회원작성글 병아리연구원  |  2020.10.08
Q. BALB/c mouse, HCC model 관련 질문입니다.
안녕하세요 HCC model을 만들고 있는 대학원생입니다.   기존 C57BL/6 mouse에서 BNL 1ME A.7R.1 (ATCC) cell line으로 HCC model을 제작하였습니다. BNL 1ME A.7R.1을 1X10^6 cells로 S.C에 TP할 경우, 일주일 정도 지나면 Tumor가 발생하였습니다. 이 후 BNL 1ME A.7R.1의 Host는 BALB/c여서 기존 C57BL/6 mouse로 모델을 만들 경우 immunology 실험에 맞지 않아 mouse를 BALB/c 로 바꿔 모델을 만들고 있습니다. 세포의 경우 기존과 동일하게 BNL 1ME A.7R.1로 1X10^6 cells을 S.C에 TP하였는데, Tumor의 생성은 C57BL/6와 비슷하게 7일정도 지나면 solid Tumor가 발생하였습니다.  하지만 점점 Tumor size가 작아지고, 결국 Tumor가 없어졌습니다. IHC 결과 면역세포들이 Tumor 부위에 많이 몰려있는 것을 확인하였고, 자가치유되는 것으로 확인하였습니다. 모델을 만들어야하는데, mouse 스스로 자가치유함으로써 모델이 만들어지지 않는 경우입니다.. 같은 경우를 겪으신 분들이 있는지, 해결하셨다면 그 방법을 여쭤보고 싶습니다.  
회원작성글 alsrud2930  |  2020.09.28
Q. 렘데시비르 결합부위
안녕하세요. 렘데시비르의 작용 기전을 찾아보니 RNA 중합효소에 결합한다고 알고 있던 것이 유전자에 결합한다고 되어 있고, 어떤 자료는 RNA 중합효소를 저해한다고 되어 있습니다.  렘데시비르가 정확히 어디에 결합하여 약물로써 작용하는 것인가요? 전문가 분들의 도움을 구합니다. 부탁드립니다.
회원작성글 DSB  |  2020.09.26
프로토콜 [연재][후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트] #5_EAE 모델 이해하기
* 본 글은 "BRIC Bio통신원의 연재"에 올려진 동일한 제목의 컨텐츠를 "프로토콜"에서도 소개하기 위해 동일한 내용으로 올렸습니다(클릭시 연재글로 이동).     마우스를 이용한 면역학 연구의 궁극적인 목표는 마우스로부터 얻은 지식을 바탕으로 사람의 면역 시스템을 이해하고 면역 관련 질병들을 치료하는데 있습니다. 그렇기 때문에 사람에게서 나타나는 면역 관련 질병들과 유사한 질병을 마우스 내에서 재현해야 할 필요가 있습니다. 마우스를 이용한 다양한 면역 관련 질병 모델들이 존재하는데, 이번 글에서는 자가면역질활 중 다발성 경화증(Multiple sclerosis)의 마우스 질병 모델인 EAE(Experimental autoimmune encephalomyelitis)에 대한 소개를 하려고 합니다.   1. 들어가는 글: 자가면역질환은 무엇인가? 우리 몸의 면역체계가 존재하는 일차적인 목적은 외부에서 우리 몸으로 침투하는 적들(균, 세균, 바이러스 등등)을 인식하고 제거하기 위한 것이라고 말 할 수 있습니다. 하지만 때때로 외부 병원균이 아닌 몸에 있는 조직을 적으로 잘못 인식하고 스스로를 공격하는 면역세포들이 생깁니다. 물론 이런 면역세포들을 억제하는 방법들이 있지만 (Immune tolerance), 다양한 이유로 억제가 풀리고 자신을 공격하는 면역세포들이 활동하게 되는 경우들이 발생합니다. 결과적으로 면역시스템이 자신을 공격함으로 인해 조직 및 기관의 가역적 또는 비가역적 손상이 일어날 수 있으며, 이러한 면역 관련 질병을 자가면역질환이라고 합니다. 류마티스성 관절염, 전신성 홍반 루프스, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 중증근무력증 등등 염증이 발생하여 손상될 수 있는 조직의 종류만큼 다양한 자가면역질환들이 있습니다. 자가면역질환의 종류에 따라 그 원인이 되는 면역세포의 종류에도 조금씩 차이가 있고 기여도도 차이가 있습니다. 하지만 자가면역질환 연구에 대표적으로 사용되는 질병모델들이 존재하며, 그중 하나인 EAE를 소개하도록 하겠습니다.   2. Multiple sclerosis VS EAE 신경세포의 Axon은 Myelin이라고 불리는 여러 단백질과 지질로 구성된 층이 감싸고 있으며, Myelin은 신경 신호의 전달 속도를 증가시킴으로써 신경 신호 전달에 있어서 중요한 기능을 하는 구조입니다. 하지만 몸 안의 면역세포들이 신경세포의 Myelin을 구성하는 단백질을 타겟으로 염증반응을 일으키는 경우 Myelin이 파괴되어 (Demyelination) 신경 신호 전달에 문제가 발생하게 됩니다. 이렇게 과도한 면역반응으로 인해 중추신경계에서 Demyelination이 일어남으로써 신경계에 문제가 생기는 자가면역질환이 다발성 경화증(Multiple sclerosis)입니다. 그리고 사람에게서 발생하는 Multiple sclerosis(MS)를 마우스에서 재현한 질병 모델이 바로 EAE입니다. 비록 MS의 기전의 이해 및 치료방법 개발을 위해 EAE를 이용하지만, EAE가 MS를 완벽하게 재현해내지는 않습니다. 질병 모델로서 EAE가 갖는 대표적인 한계점들을 먼저 소개하도록 하겠습니다. 1) EAE는 인위적인 Immunization에 의한 질병이다. 자가면역질환인 MS는 체내에서 다양한 원인들로 인해 Immune tolerance가 깨지고 이로 인해 Myelin을 인식하는 Autoreactive T cell이 활성화되어 발생합니다. 하지만 EAE는 Myelin을 구성하는 단백질 중 하나인 MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein)단백질을 (심지어 전체가 아닌 일부 Peptide) CFA라고하는 강한 Adjuvant와 섞어 Immunization함으로써 인위적으로 MOG를 인식하는 T cell을 활성화시키는 모델입니다. 물론 MS의 경우에도 MOG 단백질이 주요 자가항원으로 작용한다는 부분에서 유사성을 갖지만(Kerlero de Rosbo et al., 1993), EAE에서 사용되는 MOG peptide는 MOG 단백질의 일부일 뿐 아니라 MS에 영향을 줄 수도 있는 MOG 단백질의 Post translational modification도 갖지 않기 때문에 실제 MS의 발병기전에서 MOG 단백질의 역할과 EAE에서 MOG peptide의 역할이 차이가 생길 수 있습니다. 게다가 EAE 모델은 어떻게 Immune tolerance가 깨지는가 보다는 이미 무너진 Immune tolerance 상황에서 어떤 면역세포들이 어떤 방식으로 질병을 유도하는가에 더 초점을 맞춘 연구방법입니다. 이는 대부분의 자가면역질환 모델들이 갖는 한계점이긴 하지만, 이런 이유로 실제 MS의 발병 초기에 어떻게 Immune tolerance가 깨지는지에 대한 연구에는 적합하지 않습니다. 추가적으로 EAE는 실제 MS와는 조금 다른 병리학적 특징들을 나타내게 되는데, 대표적으로 EAE의 경우 MS와는 달리 뇌에 비해 척수(Spinal cord)에 좀더 편향된 염증이 유발됩니다(Lassmann and Bradl, 2017). 2) EAE는 CD4 T cell에 의해 유도되는 질병 모델이다. EAE가 유도되어 Spinal cord로 면역세포들이 유입되어 신경세포의 Demyelination을 유도하는 과정에는 Dendritic cell, neutrophil, monocyte, CD8 T cell, CD4 T cell, γδ T cell 등등 다양한 면역세포들이 관여합니다. 다양한 면역세포들이 적절하게 영향을 주고받을 때 EAE가 유도되지만, 일반적으로 CD4 T cell의 비중이 매우 크다고 얘기합니다. 앞서 언급한대로 EAE를 유도하는 과정자체가 CFA라는 강한 면역반응을 유도할 수 있는 Adjuvant를 사용하는데, 이런 과정은 MOG peptide를 인식하는 CD4 T cell의 활성을 유도하고 상대적으로 CD8 T cell의 활성은 크게 유도하지 못하기 때문이며, MOG를 인식하는 CD4 T cell의 Adoptive transfer만으로도 EAE가 유도되기 때문입니다. 또한 CD4 T cell이 제대로 기능을 하지 않으면 EAE 유도자체가 되지 않습니다(Carr et al., 2017). 한 가지 극단적인 예를 들자면, MOG35-55 peptide를 이용한 일반적인 EAE의 경우 B cell이 존재하지 않아도 문제없이 EAE가 유도됩니다(Molnarfi et al., 2013). 하지만 실제로는 B cell과 B cell에 의해 만들어지는 항체가 MS의 발병과정에 연관이 있습니다(von Budingen et al., 2011). 따라서 이 부분만 보더라도 EAE가 완벽하게 MS의 병리학적 특성 및 기전을 재현한다고 할 수 없습니다. 이런 부분을 보완하고자 mouse MOG peptide 35-55를 이용하는 일반적인 EAE와 달리 recombinant human MOG를 이용하거나(Molnarfi et al., 2013) Myelin을 구성하는 또다른 단백질인 PLP를 이용해서(Boyden et al., 2020) B cell-dependent EAE 모델을 개발해 MS에서 B cell의 기능을 연구하기도 합니다. 이러한 한계점이 있음에도 불구하고 EAE는 자가면역질환에 기여하는 면역세포들의 성질 및 MS의 기전 이해에 큰 도움을 주고 있는 것이 사실입니다. 모델이 갖는 한계와 실제 질병과의 유사성을 먼저 이해하고 아는 것이 궁극적으로 질병의 이해 및 치료로 가는 길이기 때문에 EAE가 갖는 특징 및 한계점을 먼저 설명했습니다.   3. Active EAE   EAE 모델은 크게 Active EAE와 Passive EAE로 구분됩니다. 일반적으로 EAE라고 하면 Active EAE를 의미하는데, 뒤에서 설명할 Passive EAE와 구분짓기 위해 Active EAE라는 명칭을 사용합니다. Active EAE를 유도하기 위해서는 항원으로 사용될 MOG peptide와 CFA가 우선적으로 필요합니다. 항원으로 사용되는 MOG는 전체 단백질이 아닌 MOG peptide 35-55를 주로 사용합니다. CFA는 Complete Freund’s Adjuvant의 약자로 비활성화 또는 건조된 Mycobacteria (M. Tuberculosis)를 포함하는 기름성분이며, 강한 면역반응을 유도하기 위한 Adjuvant로 사용됩니다. 이론적으로는 자가항원에 반응하는 T cell들은 Negative selection에 의해 발생 단계에서 제거가 됩니다. 하지만 이 과정이 결코 완벽하지는 않고, 자가항원을 인식할 수 있는 T cell들이 실제로는 만들어져서 체내에 일부 존재하게 됩니다. 그럼에도 불구하고 이러한 Autoreactive T cell은 여러 경로를 통해 활성이 억제되기 때문에 실제로는 큰 문제를 일으키지 않습니다. 또한 이런 조절 매커니즘은 꽤나 효율적이어서 마우스에 MOG peptide만 주사한다고 해서 MOG peptide를 인식하는 Autoreactive T cell들이 활성화 되지 않습니다. 하지만 강한 염증반응이 유도될 때는 이야기가 달라집니다. 매우 강한 염증반응은 앞서 설명한 조절 메커니즘을 깨고 MOG 단백질을 인식하는 Autoreactive T cell들의 활성을 유도할 수 있습니다. 따라서 강한 면역반응을 유도할 수 있는 Adjuvant가 필요한데, 위에서 언급한 CFA가 해당 목적으로 사용됩니다. 강한 면역반응을 일으킴과 동시에 MOG peptide를 항원으로 제시하여 MOG를 인식하는 T cell의 활성화를 유도함으로써 중추신경계의 Myelin이 파괴되는 과정(Demyelination)을 유도하는 것이 EAE 모델의 기본 원리입니다 (그림 1). 하지만 이 과정이 그렇게 쉽지만은 않습니다. PBS에 MOG peptide를 넣어주고 CFA와 열심히 섞어줌으로써 물과 기름이 섞인 Emulsion을 만들어줘야 하는데, 두 개의 주사기 사이에 압력을 걸어 40분 정도 반복적으로 섞어줘야 하기 때문에 손가락과 손바닥이 꽤 아픈 고된 과정입니다. 추가적으로 Bordetella pertussis라는 박테리아가 만들어내는 Pertussis toxin(PTX)을 주사하는 과정이 필요합니다. PTX의 정확한 기능은 여전히 불분명하지만 Blood brain barrier(BBB)를 약화시키거나(Lu et al., 2008), T cell anergy 유도를 억제하거나(Kamradt et al., 1991) Treg cell의 기능을 약화시킴으로써(Chen et al., 2006) Immune tolerance를 무너뜨리는데 기여하거나, IL-1β생성을 증가시키는 기전(Dumas et al., 2014) 등을 통해 EAE 유도를 촉진시키는 것으로 이해되고 있습니다. PTX는 보통 두 번 (EAE를 유도한 당일과 1~3일 뒤 한 번 더) 주사합니다.   4. Passive EAE 앞서 소개한 Active EAE는 MOG peptide를 항원으로 직접 주사함으로써 마우스 안에 존재하는 MOG-specific T cell들의 활성을 유도하는 방법이지만, Passive EAE는 MOG를 인식하는 T cell만을 다른 마우스로 Adoptive transfer함으로써 이식된 T cell에 의해 EAE가 유도되도록 하는 방법입니다. 이러한 방법으로 유도된 EAE는 앞서 소개한 Active EAE와 구분하기 위해 Passive EAE 또는 Adoptive transfer EAE로 불립니다. Passive EAE는 Th1 cell 또는 pathogenic Th17 (pTh17) cell에 의해 두 가지 방법으로 유도될 수 있습니다. 또한 Th1 cell과 pTh17 cell의 출처에 따라 또다시 크게 두 가지의 방법으로 구분될 수 있습니다. 각 세포의 출처가 어떻게 다르며, 그에 따라 어떤 차이가 있는지 소개하도록 하겠습니다 (그림 2).   1) In vitro polarized-MOG-specific T cells 앞서 연재했던 TCR transgenic mouse를 소개하는 글에서 2D2 mouse를 소개했었습니다(Bettelli et al., 2003). 해당 마우스에서 얻는 CD4 T cell은 모두 MOG peptide 35-55를 인식하는 동일한 TCR을 발현합니다. 따라서 2D2 mouse에서 얻은 Naïve CD4 T cell을 Th1 cell 또는 pTh17 cell로 In vitro 분화시킨 후, 해당 세포를 다른 Recipient mouse로 Adoptive transfer해줌으로써 Passive EAE를 유도할 수 있습니다. 2D2 naive CD4 T cell을 Th1 cell 또는 pTh17 cell 분화 조건에서 5일동안 배양하고, 2 X 106 개정도의 세포를 IV 주사로 Adoptive transfer해주면 성공적으로 EAE가 유도됩니다. Th1 cell을 분화시키기 위해서는 IL-2, IFN-γ, α-IL-4 neutralizing antibody가 사용되며, pTh17 cell을 분화시키기 위해서는 IL-6, IL-1β, IL-23, α-IL-4 neutralizing antibody, α-IFN-γ neutralizing antibody가 사용됩니다. 흥미롭게도 pTh17 cell에 의해 유도된 passive EAE의 경우 일반적인 EAE에서 발견되는 증상과는 조금 다른 증상들이 나오는 Atypical EAE가 유도됩니다(Rangachari and Kuchroo, 2013). 해당 내용에 대해서는 다음 연재글에서 조금 더 다루도록 하겠습니다. In vitro 분화된 세포들은 실제로 몸 안에서 만들어지는 Th1 cell 또는 pTh17 cell과 차이는 존재할 수 있습니다. 하지만 동일한 조건에서 세포들을 배양할 수 있기 때문에 비교적 일관성 있는 데이터를 얻을 수 있는 장점이 있습니다. 2) Ex vivo expanded-MOG-specific T cells In vitro culture의 경우 2D2 naïve CD4 T cell을 얻어서 처음부터 pTh17 cell 또는 Th1 cell로 Cell culture dish에서 분화시킨 경우입니다. 하지만 이와 다르게 이미 Active EAE가 유도된 마우스에 존재하는 MOG-specific pTh17 cell 또는 Th1 cell을 이용하는 경우도 있습니다. 이 경우는 이미 체내에서 만들어진 Helper T cell subset의 양을 증식시키는 경우라서 (물론 Polarizing cytokine을 추가하지만) In vitro가 아닌 Ex vivo에 해당합니다. 이 방법으로 MOG-specific T cell을 얻는 과정은 조금 복잡합니다. 먼저 Donor 마우스에 Active EAE를 유도해야합니다. 그러면 자연스럽게 MOG를 인식하는 T cell들이 체내에서 분화 및 증식하게 됩니다. EAE를 유도하고서 7일 뒤에는 Spleen과 Lymph node에서 면역세포 전체를 얻어내고, MOG35-55 peptide와 Polarizing cytokine을 추가하여 3일정도를 추가적으로 배양하는 과정이 필요합니다. 이 과정에서 Antigen presenting cell에 의해 MOG peptide가 CD4 T cell에게 제시되고, MOG를 인식하는 CD4 T cell들이 선택적으로 증식하게 됩니다. 또한 추가적으로 넣어준 Polarizing cytokine에 의해 Th1 cell 또는 pTh17 cell의 분화가 유도됩니다. 이렇게 MOG를 인식하는 T cell의 숫자를 늘려준 후, CD4 T cell만을 재차 분리해주는 과정이 필요합니다. 이렇게 분리해서 얻은 CD4 T cell을 마찬가지로 Recipient mouse에 Adoptive transfer함으로써 Passive EAE가 유도됩니다. 이 방법의 경우 EAE가 유도된 마우스에서 얻은 CD4 T cell을 Ex vivo 배양을 통해 양을 늘린 경우라서 앞의 In vitro 배양보다는 실제 EAE 과정에서 만들어지는 Helper T cell subset과 더 유사하다는 장점이 있습니다. 하지만 필요한 세포를 얻기까지 꽤 오랜 시간이 필요하며 EAE 유도 및 Ex vivo 세포 배양에서 추가적인 비용이 발생한다는 단점이 있습니다. 또한 In vitro culture의 경우 비교적 순수한 Th1 cell 또는 pTh17 cell subset을 얻을 수 있으나, Ex vivo culture의 경우 다른 T helper cell subset과 분화되지 않은 CD4 T cell이 일부 섞이는 것이 불가피하기 때문에 온전히 Th1 cell 또는 pTh17 cell에 의한 Passive EAE라고 말할 수 없다는 한계점이 존재합니다. 게다가 WT과 특정 유전자가 KO된 세포를 이용해서 비교할 경우 두 그룹간 차이가 Donor 마우스에 존재하는 Th1 cell 또는 pTh17 cell의 비율 자체의 차이와 MOG에 반응하는 T cell의 Clone 차이에 기인할 수도 있다는 점에서 분석에 유의해야합니다.   5. EAE 연구를 통해 개발된 치료법: Natalizumab 비록 EAE가 MS를 완벽히 재현할 수는 없지만, EAE를 통해 발견된 면역학적 기전들은 새로운 MS 치료방법들을 제시하는 성과를 가져다 주었습니다. EAE를 통한 연구를 기반으로 개발된 MS 치료법들 중 대표적인 한 가지 경우를 소개하려고 합니다. Natalizumab은 세포의 이동에 필요한 Integrin의 기능을 억제하는 항체입니다. 구체적으로 Integrin α4β1에 결합하는 단클론항체이며, CD4 T cell이 혈관에서 염증조직으로 이동하는 과정을 저해합니다. 면역세포가 염증이 일어나는 조직으로 이동하기 위해서는 몇가지 일련의 과정들이 필요합니다. 면역세포는 기본적으로 혈액 내에서 순환하고 있습니다. 따라서 특정 위치로 가기위해서는 순환을 멈추고 혈관을 구성하는 Endothelial cell에 부착하는 과정이 선행되어야 하며, 이 과정에서 면역세포가 발현하는 Integrin α4β1이 Endothelial cell일 발현하는 VCAM-1과 결합하게 됩니다(Carman and Springer, 2004). Natalizumab은 이 과정에 필요한 Integrin α4β1이 다른 Ligands와 결합하는 것을 차단함으로써 CD4 T cell이 BBB를 통과하는 것을 막는 역할을 합니다. 이러한 사실은 EAE가 유도된 Rat의 Brain tissue section에 Lymphocyte를 반응시켜 Lymphocyte가 Brain tissue section에 부착되는 In vitro adhesion assay를 이용해 발견되었습니다(Yednock et al., 1992). 여러가지 Anti-integrin antibody중에서 Integrin α4에 결합하는 Antibody를 처리하였을 때 Lymphocyte가 Brain tissue section에 붙는 정도가 감소하는 것을 통해 해당 기전이 발견되었습니다. 이를 기초로 개발된 단클론항체인 Natalizumab은 2004년 미국 FDA의 승인을 얻어 MS 치료에 사용되고 있습니다(Steinman, 2012) (그림 3). 하지만 Natalizumab의 사용이 오히려 면역학적 방어에 필요한 Th1 cell을 감소시킴으로 인해 뇌에서의 JC virus의 기회감염을 일으키고, 결과적으로 Natalizumab을 장기간 사용할 경우 progressive multifocal leukoencephalopathy라는 질병에 취약해지는 부작용도 있습니다(Bloomgren et al., 2012). 또한 MS 발병 및 악화에 기여하는 Th17 cell의 경우 Integrin α4의 발현이 낮고, Natalizumab으로는 Th17 cell의 이동을 효과적으로 막기에는 어렵다는 제한점이 있습니다(Glatigny et al., 2011; Rothhammer et al., 2011; Schneider-Hohendorf et al., 2014).   6. 마치는 글 사람에게서 발생하는 면역 관련 질병들을 제대로 이해하고 치료방법을 제시하기 위해서는 실험 동물에서 유사한 질병을 재현하는 것이 필요합니다. 이러한 목적으로 MS 연구에 사용되고 있는 EAE라는 질병 모델에 대해 이론적인 부분을 중심으로 소개했습니다. 다음 연재에서는 EAE를 통해 얻을 수 있는 데이터와 EAE를 이용한 연구를 함에 있어서 필요한 실제적인 팁들을 소개하도록 하겠습니다. 자가면역질환을 연구하고있는 대학원생들이 이번 연재를 통해 EAE라는 질병 모델에 대한 이해가 확장되었기를 바라며 이번 글을 마무리 짓겠습니다. References Bettelli, E., Pagany, M., Weiner, H.L., Linington, C., Sobel, R.A., and Kuchroo, V.K. (2003). Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific T cell receptor transgenic mice develop spontaneous autoimmune optic neuritis. J Exp Med 197, 1073-1081. Bloomgren, G., Richman, S., Hotermans, C., Subramanyam, M., Goelz, S., Natarajan, A., Lee, S., Plavina, T., Scanlon, J.V., Sandrock, A., et al. (2012). Risk of natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy. N Engl J Med 366, 1870-1880. Boyden, A.W., Brate, A.A., and Karandikar, N.J. (2020). Novel B cell-dependent multiple sclerosis model using extracellular domains of myelin proteolipid protein. Sci Rep 10, 5011. Carman, C.V., and Springer, T.A. (2004). A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Biol 167, 377-388. Carr, T.M., Wheaton, J.D., Houtz, G.M., and Ciofani, M. (2017). JunB promotes Th17 cell identity and restrains alternative CD4(+) T-cell programs during inflammation. Nat Commun 8, 301. Chen, X., Winkler-Pickett, R.T., Carbonetti, N.H., Ortaldo, J.R., Oppenheim, J.J., and Howard, O.M. (2006). Pertussis toxin as an adjuvant suppresses the number and function of CD4+CD25+ T regulatory cells. Eur J Immunol 36, 671-680. Dumas, A., Amiable, N., de Rivero Vaccari, J.P., Chae, J.J., Keane, R.W., Lacroix, S., and Vallieres, L. (2014). The inflammasome pyrin contributes to pertussis toxin-induced IL-1beta synthesis, neutrophil intravascular crawling and autoimmune encephalomyelitis. PLoS Pathog 10, e1004150. Glatigny, S., Duhen, R., Oukka, M., and Bettelli, E. (2011). Cutting edge: loss of alpha4 integrin expression differentially affects the homing of Th1 and Th17 cells. J Immunol 187, 6176-6179. Kamradt, T., Soloway, P.D., Perkins, D.L., and Gefter, M.L. (1991). Pertussis toxin prevents the induction of peripheral T cell anergy and enhances the T cell response to an encephalitogenic peptide of myelin basic protein. J Immunol 147, 3296-3302. Kerlero de Rosbo, N., Milo, R., Lees, M.B., Burger, D., Bernard, C.C., and Ben-Nun, A. (1993). Reactivity to myelin antigens in multiple sclerosis. Peripheral blood lymphocytes respond predominantly to myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Clin Invest 92, 2602-2608. Lassmann, H., and Bradl, M. (2017). Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathol 133, 223-244. Lu, C., Pelech, S., Zhang, H., Bond, J., Spach, K., Noubade, R., Blankenhorn, E.P., and Teuscher, C. (2008). Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. J Neurosci Res 86, 2624-2640. Molnarfi, N., Schulze-Topphoff, U., Weber, M.S., Patarroyo, J.C., Prod'homme, T., Varrin-Doyer, M., Shetty, A., Linington, C., Slavin, A.J., Hidalgo, J., et al. (2013). MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies. J Exp Med 210, 2921-2937. Rangachari, M., and Kuchroo, V.K. (2013). Using EAE to better understand principles of immune function and autoimmune pathology. J Autoimmun 45, 31-39. Rothhammer, V., Heink, S., Petermann, F., Srivastava, R., Claussen, M.C., Hemmer, B., and Korn, T. (2011). Th17 lymphocytes traffic to the central nervous system independently of alpha4 integrin expression during EAE. J Exp Med 208, 2465-2476. Schneider-Hohendorf, T., Rossaint, J., Mohan, H., Boning, D., Breuer, J., Kuhlmann, T., Gross, C.C., Flanagan, K., Sorokin, L., Vestweber, D., et al. (2014). VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med 211, 1833-1846. Steinman, L. (2012). The discovery of natalizumab, a potent therapeutic for multiple sclerosis. J Cell Biol 199, 413-416. von Budingen, H.C., Bar-Or, A., and Zamvil, S.S. (2011). B cells in multiple sclerosis: connecting the dots. Curr Opin Immunol 23, 713-720. Yednock, T.A., Cannon, C., Fritz, L.C., Sanchez-Madrid, F., Steinman, L., and Karin, N. (1992). Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin. Nature 356, 63-66.      
박은총  |  2020.09.18
Q. 논문 검색방법을 찾고 싶습니다
myeloma도 mAb를 생산하는 것으로 알고 있습니다마는, 이를 plasma cell과 fusion시켜 hybridoma 형성하여 mAb를 형성하는 방법 이외에 특정 plasma cell을 myeloma로 유도시켜 mAb를 생산할 수 있는 방법이 있을까요? 또 이에 대한 논문의 검색법을 알고 싶습니다ㅠㅠ 현재 고등학생이다보니 쉽지 않네요
회원작성글 Cephe1d  |  2020.09.12
Q. 점막 면역학 mucosal immunology 에 대한 책이나 논문 추천 부탁드립니다.
안녕하세요. 장내미생물을 연구하다가 장내 점막환경과 면역이 밀접한 관련이 있다는 점이 흥미가 있어 점막 면역학과 장내미생물 연구를 연결하여 공부하려고 합니다.   혹시 점막면역의 기본을 공부하기 위한 책이나 논문이 있을까요? 일반 면역학에 해당 내용이 좀 언급이 되어 있는지요?   아니면 점막에 대하여 깊이 있게 공부하려면 화공과 등에서 배우는 계면공학 관련 서적 중에 단초가 될 만한 책이 있을까요? 감사합니다.        
회원작성글 밝음지혜  |  2020.09.08
Q. balf에서 대식세포, 림프구, 중성구, 호산구 cell counting
천식 mouse balf에서 면역세포 counting하려고합니다. 어떤 염색약을 사용해야하는지 업체에 맡겨야하는지 아시는분있으신가요 그냥 cell counting하는 방법처럼  현미경으로 세는것이 맞는지 알려주세요ㅠㅠ
회원작성글 우니이이아이  |  2020.09.06
Q. 특정인터페론이 증가하면 다른인터페론은 감소하게 되나요?
사이토카인의 총량보존의 법칙같은 것이 있어서 특정인터페론이 증가하면 다른인터페론은 감소하게 되나요?   이러한 내용으로 쓰여진 논문을 알고계시면 알려주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 dltmf  |  2020.09.04
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