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Q. FAM probe 형광 발현 문제,,,,
안녕하세요, 제가 하다하다 안돼서 이곳에 글을 남깁니다. 제가 얼마전부터 NTC 샘플에서 계속 형광이 증가가 되는 문제가 발생하고 있는데요, 처음에는 오염인줄 알고 시약도 다 새로 주문을 해서 실험을 계속 하고 있는데 여전히!!! NTC 샘플에서 형광이 선형적 증가을 하고 있습니다. 혹시나 해서 gel도 내려봤는데 당연히!!!! amplicon은 보이지 않고요,,,, Probe에 손상이 갔나해서 새로 주문을 하고 별짓을 다해도 계속 이런 문제가 발생하네요,,,, 사용하고 있는 Probe는 FAM-TAMRA 입니다,,,, 도대체 왜 그런지 작은 힌트라도 좋으니,,,PCR 고수님들 tip좀 주세요~~~~  
회원작성글 할까말까해  |  2022.12.05
Q. 혈장 농축 방법 문의
안녕하세요. 혈장 내 존재하는 ctDNA를 이용하여 진단을 하려고 합니다. 전혈을 이용하여 혈장을 분리하는데, ctDNA 추출 제품에서 혈장을 사용할 수 있는양이 6cc로 한계가 있습니다. 전혈에서 혈장을 농축할 수 있는 방법이 있나요? (10cc 이상의 혈장을 농축하여 ctDNA를 추출하고자 합니다.)   좋은 방법이 있으시면, 답변 부탁 드리겠습니다. 감사합니다.
회원작성글 TSReQM  |  2022.12.05
Q. mtDNA 추출
안녕하세요.  cell에서 mtDNA를 추출해 qPCR을 하려고 합니다. 사용 kit 는 DNeasy blood & tissue (qiagen) 사용 예정입니다. 제가 궁금한 것은 미토콘드리아 DNA 추출 키트를 사용하지 않더라도 추출이 가능할지가 궁금합니다. 혹시 사용해보신분들 계신지 여쭤보고 싶습니다.
회원작성글 똑똑해지자  |  2022.12.05
Q. cloning 질문
밑에분 질문에 저 또한 궁금한점이 생겨 질문드립니다.   insert DNA를 얻기 위해 PCR을 진행하는데 PCR 진행시 Primer에 Restriction enzyme site를 붙여 진행한다고 알고있습니다. 준비한 insert와 vector는 Restriction enzyme 가 동일해야되는걸로 알고있는데요 insert DNA에 vector에 cloning할 곳의 제한효소가 없다면, 그냥 insert DNA 에 제한효소 site를 넣은 primer로 PCR을 진행하여 insert를 얻으면 되는건가요?    
회원작성글 분자생물학도  |  2022.12.05
Q. cloning 질문드립니다.
안녕하세요 이번에 cloning을 처음하게 되는 학부생입니다. insert DNA, vector를 얻어야되는것부터 시작하게 되었는데요 insert를 pcr을 통해서 얻은 다음 vector와 제한효소 처리 후 ligase를 통해 합쳐진다는 원리는 알겠습니다. 우선 insert를 얻기 위해 insert가 들어있는 vecotr에서 제한효소로 cut한 다음 PCR을 통해 얻은 다음 cloning하고 싶은 vector에 insert를 넣을때 같은 제한효소를 이용하여 cut한 다음 ligase로 연결 이라고 이해하고 있는데, 그럼 insert를 얻을때와 insert 와 vector 같은 제한효소가 없을때는 어떻게 해야될까요? 또한 유전자를 2개 이어 붙여서 cloning 할때, 그냥 둘 유전자를 이어붙은 primer를 design해주면 되는건지, 각각을 같은 제한효소로 cut한 다음 이어붙여야 하는건지 머릿속이 정리가 안되서 질문드립니다.
회원작성글 얼마안남았다  |  2022.12.05
Q. cloning 관련 질문드립니다.
안녕하세요.  관련 분야 대학생입니다. 논문을 읽다 이해가 잘 가지 않는 부분이 생겨 질문 드립니다. 아직 전공에 대한 이해 지식이 낮아 엄청 기초적인 질문이지만 부탁드려요ㅠㅠ insert  gene은  Sal I - gene - Xho I으로 되어 있는데 vetor의 Xho I site 에 cloning이 가능한가요?? 2개의 enzyme site 가 아닌 한곳에 cloning 이 어떻게 가능한지 궁금합니다ㅜㅜ!
회원작성글 Rhk  |  2022.12.04
Q. PCR 초보 질문입니다ㅠㅠ
PCR을 돌리고 나서 전기영동하고 나면 300bp 또는 500bp에 밴드가 나옵니다 근데 여기서 long pcr밴드를 확인하고자 할때 pcr reaction mix의 람다dna양을 늘리는건가요? 아니면 primer를 더 긴 길이로 바꿔줘야하는건가요?
회원작성글 호로롱슝  |  2022.12.03
Q. pcr 밴드보는법?
3번염색체에 위치한 STR마커인 D3S1358 marker를 이용해서 구강상피세포로 PCR진행했는데요.. 결과가 이렇게 나왔는데 1.이때 PCR product의 크기는 약125bp, 130bp, 약170bp, 180bp 이렇게 총 4개 나온거 맞나요?? 대립유전자는 2개라서 2개만 나와야하는거 아닌지,,왜 4개가 나왔는지 아무리 생각해도 모르겠습니다ㅠㅠ   2. 여기서 각 allele의 빈도를 알고싶은데 이때 각 allele라는게 1번에서는 125,127/ 170,180 이렇게 4가지 밴드를 각 allele라고 보는게 맞을까요?(이게맞다면 allele가 4개가 있는건가요>) 아니면 125,127 이거가 한 유전자의 allele이고 170,180이게 또 한유전자의 다른 allele라고 보는게 맞는건가요?
회원작성글 갈색솜뭉치  |  2022.12.02
Q. Real time PCR 기초 질문 입니다.
안녕하세요. Real time PCR을 막 배우게 된 초보 연구원입니다. 다름이 아니라 housekeeping gene은 모든 세포에서 일정하게 발현되는 유전자로 알고 있는데요. 제가 실험에 사용한 gene이 actin-B이거든요. 근데 Ct 값이 28 부근에서 떠서요. 원래는 어느 Ct 값에서 뜨는게 정상인지에 대해 여쭤보고 싶습니다.
회원작성글 medi92  |  2022.12.02
Q. Fungi cloning...
안녕하세요   현재 fungi cloning을 진행하려고 하는 대학원생입니다..   혹시 fungi cloning protocol있으신 분 있을까요..?   제발 공유 부탁드립니다..ㅠㅠ
회원작성글 으리으링  |  2022.12.02
Q. overlap pcr
vector에서 50bp만 원하는 gene으로 바꾸기 위해서 pcr을 진행했는데 원하는 원래대로 라면 3kb의 band가 나와야되는데 pcr만 하면 700bp가 나와서 원하는부분에서 pcr이 된거같지 않아 overlapping pcr로 이어 붙여 만들려고 합니다. 제가 overlap은 처음이라 궁금한게 많아 질문드립니다. 1. 지금 제가 가지고 있는 vector가 circular인데 우선 이걸 linear로 자르고 시작해야되는건가요? 2. 제가 원하는기존에 있던 gene이 아닌 원하는 gene을 넣어주기 위한 pcr fragment, 기존에 잘라서 이어붙이는 fragment부분 해서 2개를 이어붙이는건지… 아니면 기존 circular를 2개의 fragment로 잘라서 총3개의 fragment를 이어붙이는건지 질문드려도 될까요?
회원작성글 얼마안남았다  |  2022.12.02
Q. antibiotics gene genome inserted 균주와 plasmid harboring 균주의 분리
안녕하세요 E. coli LB sub-culture 에 대해서 질문이 있습니다 두가지 균주가 혼합된 스톡을 분리하려고 합니다 1. 항생제 저항성 유전자(cmR)가 plasmid (정확히 phage origin)로 존재하는 균주  2. 항생제저항성 유전자가 genome 상에 integration 되어 있고 2번의 plasmid 가 같이 존재하는 균주  이때 각각 LB와 LCm(LB+chloramphenicol) liquid 배지에서 여러번 dilution 해서 키워봤으나 항생제 저항성유전자가 integration 된 균주는 growth가 느리기 때문에  LB dilution 시 1번의 균주에서 plasmid 가 빠진 wild type 균주가 분리되고 LCm dilution 시 1번균주가 분리되는 현상이 일어납니다 또한, phage origin 이기 때문에 single colony 가 단일 genotype 이라고 단정지을 수 없는 문제가 있습니다   LB 와 LCm 을 번갈아 가면서 키우면 효과가 있을가요? 아니면 다른 효과적인 방법이 있다면 알려주시면 감사하겠습니다  
회원작성글 애오애오애애오  |  2022.12.01
Q. blunt end ligation
blunt end ligation하다가 잘 안되는 부분이 있어 질문 올립니다. Vector는 2.7kb, 6kb로 Sma1 처리를 하여 blunt end, Insert는 1.2kb (Pfu polymerase, PCR product)로 둘다 blunt end 입니다. 농도랑 순도 모두 100ng/ul 이상, 2.0 (260/280)이며 ligation 시 10:1 (Insert/Vector), 4℃, O/N로 진행하고 있습니다. 근데 계속 Vector selt ligation만 나와 고민 중입니다. (제한효소, Insert primer로 확인) 저가 생각한 대안은 아래와 같습니다. 1) Insert/Vector 비율 늘리기 2) ligation 시 Sma1 소량 넣어 진행 (buffer, Sma1 volume 등 정확한 protocol은 모름) 혹 이것 외에 더 효율적인 방법이나 놓친 부분이 있을까요?    
회원작성글 구릅  |  2022.12.01
Q. PCR시 100bp이하의 band 검출 관련입니다.
PCR을 했는데 원래 detect 되어야하는 size에서는 band가 안나오고 2번째 line과 같이 100bp 이하에서 band가 나왔습니다... 다른 유전자가 검출된 건가 싶어 Gel extraction, TA-cloning후 prep 해서 sequencing을 보냈는데 결과에서 다른 유전자가 아닌 T-vector로 나옵니다. 이유 알고계신 분 있으시면 꼭 답변 부탁드립니다 ㅠㅠ 감사합니다.  
회원작성글 Cheddar  |  2022.11.30
Q. SDM 안되는 polymerase도 있나요?
이전에 SDM(Site-directed mutagenesis) 관련하여 질문을 올렸었습니다. (https://www.ibric.org//myboard/read.php?Board=exp_qna&id=789382)   골자는 SDM이 되지 않는 것에 대해서 조언을 구하는 글이었는데.. 결국 성공하긴 했습니다만, 여전히 매우 낮은 효율때문에 다시 질문을 올리게 되었습니다.   현 상황을 요약하면 다음과 같습니다.     vector 전체 size는 3.5kb로 작은 편이고,   primer design은 다음과 같이 C ▶ T로 바꾸는 것을 목표로 하여, 33mer 로 design 하였습니다.   snapgene 상에서의 Tm값은 63도로 계산되나, 사실 primer 자체는 Agilent quickchange webdesign tool로 design 한 것이며, Agilent quickchange protocol은 annealing Tm 값을 55도 기준으로 맞춰준다고 합니다.     PCR mixture : total volume 50ul (high fidelity Pfu)에 template vector 500ng (기존 200ng)   PCR cycle :  95°C 30s 95°C 30s 55°C 60s 68°C 4:30s (기존 kb/30s 에서 kb/1min로 수정) step 2부터 X 18  68°C 13:00   PCR이 완료되면, 바로 PCR product에 DpnI 1ul 넣고 37°C 에서 6h incubation    그리고 com-cell에 heatshock 주고, 1ml plain LB에서 120min (기존 40min) 돟안 shaking incubation   마지막으로 1ml LB culture medium centrifugation 하여, 가라앉은 com-cell pellet과 soup조금만 남기고, 적당히 pipeting하여 suspened하게 만들고 Amp(marker입니다.) plate에 spreading       빨간색으로 표기한 부분이 저번 질문에서 올린 protocol과 다르게 한 부분입니다.   이렇게 수행하였더니 colony 3개를 얻을 수 있었습니다.. 물론 sanger 돌려보니 SDM 확인은 잘 됐는데요,   고작 3.5kb로 매우 작은 vector에서, 그것도 base 하나 바꾸는데 이렇게 효율이 안나오는 것도 이상하고, 이런 상태라면 더 큰 vector에서 a.a를 바꾸는 경우에는 아예 colony가 안뜰 것 같다는 걱정이 됩니다.   그래서 지금 문제를 찾고 있는데..       우선 총 2종류의 pfu기반의 high fidelity polymerase로 test를 진행하였습니다.   조건은 template 200ng template 500ng template 500ng+DMSO 로 잡고 진행하였습니다.   PCR 직후의 gel 사진을 보시면 (이때는 깜빡하고 control로 template을 걸지 못했습니다.. ㅠ) TOYOBO의 polymerase의 band intensity가 훨씬 높습니다.   사실 TOYOBO가 thermo보다 activity가 훨씬 높다는 건 기존에 잘 알고 있어서 해당 결과는 충분히 납득할 수 있었습니다.             Dpn1 4hr 처리 이후의 gel 사진입니다.   여전히 TOYOBO의 band intensity가 훨씬 높습니다. 해당 결과만 보면 무조건 TOYOBO에서 colony가 잘 떠야하는데..   결과는 thermo : template 500ng (w/o DMSO) 조건 딱 하나에서만 3개의 colony를 얻을 수 있었습니다.     저는 이 결과가 도저히 이해가 가질 않네요.   분명히 Dpn1 처리 이후, transformation 직전에 gel 사진에서는 TOYOBO의 band intensity가 훨씬 높은데, 정작 되는건 thermo에서, 그것도 매우매우 낮은 효율로 되는게 이상합니다.   본문에서 진행한 실험 말고도, 여태까지 try를 모두 TOYOBO로 했었는데 전부 안되는 것으로 보아 현재까지는 SMD을 수행하는데 있어 TOYOBO polymerase가 부적합 하다고 밖에는 생각되지 않습니다.   그래서 TOYOBO maual을 잘 찾아보니까..         해당 pol에는 3' exonuclease activity가 있다고, enzyme cut 하기 전에 purify하라고 나와있는데, 이것 때문일까요..?   근데 3' exo activity는 pfu 기반이면 다 있을 수 밖에 없는 건데, (klenow fragment가 아닌 이상에야) 왜 TOYOBO만 그런걸까요..         관련하여 선생님들의 조언과 의견을 여쭤보고 싶습니다.   감사합니다.
회원작성글 neuronal p..  |  2022.11.29
Q. Transformation 효율이 너무 안좋습니다.. 저와 비슷한 경험 하신분 있으신가요??ㅠㅠ
안녕하세요 현재 대학원 석사 1년차입니다. 원래 게속해서 진행해온 cloning과 transformation이 8월달 부터 인가 뭔가 점점 이상해졌습니다. 저희가 기존에 만든 C-cell을 이용해서 계속해서 transformation을 진행했는데요, 8월달 부터 transformation을 한 이후에 mini-prep을 진행해온 결과 원래는 300-400ng으로 잘 나왔었는데 어느순간 갑자기 50ng으로 확 효율이 떨어졌습니다.(mini prep kit 사용했습니다.) 너무 이상해서 여러번 transformation도 해보고 배지도 다 바꾸고 새로 다 만들어서 했는데도 이상해서 C-cell이 문제겠거니 해서 다른 랩에서 얻어온 C-cell을 이용해서 transformation을 해본 결과 비슷하게 나왔습니다. 그래서 C-cell을 사서 새로 transformation을 했는데 다행히 colony가 잘 떠서 liquid culture을 진행했는데요, 아니나 다를까 또 mini-prep을 진행한 결과 50ng밖에 안나왔습니다...ㅠ 심지어 안자란것도 있습니다..ㅜ antibiotic marker는 ampicilin을 이용하였구요.. 새로 산 DNA가지고도 transformation을 했는데 하나도 자라질 않았네요.. 일단 저희 학교 내 실험실에서 해볼 수 있는 모든 경우의수를 다 해보았는데 도저히 돌파구가 보이지 않네요... 혹시 저와 같은 비슷한 경험을 해보신 분이나 problem solving하신 분들 있으신가요??ㅠㅠ 
회원작성글 또찌까까  |  2022.11.29
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