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Q. Beta-hexosaminidase 방출 측정 실험을 하려고 합니다.
특정 시료가 알러지를 유발하는지를 알아보기 위해 Beta-hexosaminidase 방출 측정 실험을 진행하려고 합니다. 실험 과정으로  1. RBL-2H3을 seeding하고 배양한 다음 Anti-DNP IgE(Sigma)가 들어간 media를 처리 해준다. 2. IgE media를 제거하고 시료가 들어간 농도별 sample media를 분주해 준 다음 배양한다. 3. 상층액과 Beta hexosaminidase Activity assay kit(CELL BIOLABS)를 사용 하여 측정한다. 이렇게 과정을 짰는데, 저희 실험실에서는 알러지 관련 실험을 이전에 해 본 적이 없고 제가 처음이라 알아보고 방법을 짜볼려고 하는데 이렇게 해도 될지 고쳐야 할 부분이 있는지 조언을 구하고자 질문 올립니다.  
회원작성글 병아리연구원  |  2020.10.08
Q. BALB/c mouse, HCC model 관련 질문입니다.
안녕하세요 HCC model을 만들고 있는 대학원생입니다.   기존 C57BL/6 mouse에서 BNL 1ME A.7R.1 (ATCC) cell line으로 HCC model을 제작하였습니다. BNL 1ME A.7R.1을 1X10^6 cells로 S.C에 TP할 경우, 일주일 정도 지나면 Tumor가 발생하였습니다. 이 후 BNL 1ME A.7R.1의 Host는 BALB/c여서 기존 C57BL/6 mouse로 모델을 만들 경우 immunology 실험에 맞지 않아 mouse를 BALB/c 로 바꿔 모델을 만들고 있습니다. 세포의 경우 기존과 동일하게 BNL 1ME A.7R.1로 1X10^6 cells을 S.C에 TP하였는데, Tumor의 생성은 C57BL/6와 비슷하게 7일정도 지나면 solid Tumor가 발생하였습니다.  하지만 점점 Tumor size가 작아지고, 결국 Tumor가 없어졌습니다. IHC 결과 면역세포들이 Tumor 부위에 많이 몰려있는 것을 확인하였고, 자가치유되는 것으로 확인하였습니다. 모델을 만들어야하는데, mouse 스스로 자가치유함으로써 모델이 만들어지지 않는 경우입니다.. 같은 경우를 겪으신 분들이 있는지, 해결하셨다면 그 방법을 여쭤보고 싶습니다.  
회원작성글 alsrud2930  |  2020.09.28
Q. 렘데시비르 결합부위
안녕하세요. 렘데시비르의 작용 기전을 찾아보니 RNA 중합효소에 결합한다고 알고 있던 것이 유전자에 결합한다고 되어 있고, 어떤 자료는 RNA 중합효소를 저해한다고 되어 있습니다.  렘데시비르가 정확히 어디에 결합하여 약물로써 작용하는 것인가요? 전문가 분들의 도움을 구합니다. 부탁드립니다.
회원작성글 DSB  |  2020.09.26
프로토콜 [연재][후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트] #5_EAE 모델 이해하기
* 본 글은 "BRIC Bio통신원의 연재"에 올려진 동일한 제목의 컨텐츠를 "프로토콜"에서도 소개하기 위해 동일한 내용으로 올렸습니다(클릭시 연재글로 이동).     마우스를 이용한 면역학 연구의 궁극적인 목표는 마우스로부터 얻은 지식을 바탕으로 사람의 면역 시스템을 이해하고 면역 관련 질병들을 치료하는데 있습니다. 그렇기 때문에 사람에게서 나타나는 면역 관련 질병들과 유사한 질병을 마우스 내에서 재현해야 할 필요가 있습니다. 마우스를 이용한 다양한 면역 관련 질병 모델들이 존재하는데, 이번 글에서는 자가면역질활 중 다발성 경화증(Multiple sclerosis)의 마우스 질병 모델인 EAE(Experimental autoimmune encephalomyelitis)에 대한 소개를 하려고 합니다.   1. 들어가는 글: 자가면역질환은 무엇인가? 우리 몸의 면역체계가 존재하는 일차적인 목적은 외부에서 우리 몸으로 침투하는 적들(균, 세균, 바이러스 등등)을 인식하고 제거하기 위한 것이라고 말 할 수 있습니다. 하지만 때때로 외부 병원균이 아닌 몸에 있는 조직을 적으로 잘못 인식하고 스스로를 공격하는 면역세포들이 생깁니다. 물론 이런 면역세포들을 억제하는 방법들이 있지만 (Immune tolerance), 다양한 이유로 억제가 풀리고 자신을 공격하는 면역세포들이 활동하게 되는 경우들이 발생합니다. 결과적으로 면역시스템이 자신을 공격함으로 인해 조직 및 기관의 가역적 또는 비가역적 손상이 일어날 수 있으며, 이러한 면역 관련 질병을 자가면역질환이라고 합니다. 류마티스성 관절염, 전신성 홍반 루프스, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 중증근무력증 등등 염증이 발생하여 손상될 수 있는 조직의 종류만큼 다양한 자가면역질환들이 있습니다. 자가면역질환의 종류에 따라 그 원인이 되는 면역세포의 종류에도 조금씩 차이가 있고 기여도도 차이가 있습니다. 하지만 자가면역질환 연구에 대표적으로 사용되는 질병모델들이 존재하며, 그중 하나인 EAE를 소개하도록 하겠습니다.   2. Multiple sclerosis VS EAE 신경세포의 Axon은 Myelin이라고 불리는 여러 단백질과 지질로 구성된 층이 감싸고 있으며, Myelin은 신경 신호의 전달 속도를 증가시킴으로써 신경 신호 전달에 있어서 중요한 기능을 하는 구조입니다. 하지만 몸 안의 면역세포들이 신경세포의 Myelin을 구성하는 단백질을 타겟으로 염증반응을 일으키는 경우 Myelin이 파괴되어 (Demyelination) 신경 신호 전달에 문제가 발생하게 됩니다. 이렇게 과도한 면역반응으로 인해 중추신경계에서 Demyelination이 일어남으로써 신경계에 문제가 생기는 자가면역질환이 다발성 경화증(Multiple sclerosis)입니다. 그리고 사람에게서 발생하는 Multiple sclerosis(MS)를 마우스에서 재현한 질병 모델이 바로 EAE입니다. 비록 MS의 기전의 이해 및 치료방법 개발을 위해 EAE를 이용하지만, EAE가 MS를 완벽하게 재현해내지는 않습니다. 질병 모델로서 EAE가 갖는 대표적인 한계점들을 먼저 소개하도록 하겠습니다. 1) EAE는 인위적인 Immunization에 의한 질병이다. 자가면역질환인 MS는 체내에서 다양한 원인들로 인해 Immune tolerance가 깨지고 이로 인해 Myelin을 인식하는 Autoreactive T cell이 활성화되어 발생합니다. 하지만 EAE는 Myelin을 구성하는 단백질 중 하나인 MOG(myelin oligodendrocyte glycoprotein)단백질을 (심지어 전체가 아닌 일부 Peptide) CFA라고하는 강한 Adjuvant와 섞어 Immunization함으로써 인위적으로 MOG를 인식하는 T cell을 활성화시키는 모델입니다. 물론 MS의 경우에도 MOG 단백질이 주요 자가항원으로 작용한다는 부분에서 유사성을 갖지만(Kerlero de Rosbo et al., 1993), EAE에서 사용되는 MOG peptide는 MOG 단백질의 일부일 뿐 아니라 MS에 영향을 줄 수도 있는 MOG 단백질의 Post translational modification도 갖지 않기 때문에 실제 MS의 발병기전에서 MOG 단백질의 역할과 EAE에서 MOG peptide의 역할이 차이가 생길 수 있습니다. 게다가 EAE 모델은 어떻게 Immune tolerance가 깨지는가 보다는 이미 무너진 Immune tolerance 상황에서 어떤 면역세포들이 어떤 방식으로 질병을 유도하는가에 더 초점을 맞춘 연구방법입니다. 이는 대부분의 자가면역질환 모델들이 갖는 한계점이긴 하지만, 이런 이유로 실제 MS의 발병 초기에 어떻게 Immune tolerance가 깨지는지에 대한 연구에는 적합하지 않습니다. 추가적으로 EAE는 실제 MS와는 조금 다른 병리학적 특징들을 나타내게 되는데, 대표적으로 EAE의 경우 MS와는 달리 뇌에 비해 척수(Spinal cord)에 좀더 편향된 염증이 유발됩니다(Lassmann and Bradl, 2017). 2) EAE는 CD4 T cell에 의해 유도되는 질병 모델이다. EAE가 유도되어 Spinal cord로 면역세포들이 유입되어 신경세포의 Demyelination을 유도하는 과정에는 Dendritic cell, neutrophil, monocyte, CD8 T cell, CD4 T cell, γδ T cell 등등 다양한 면역세포들이 관여합니다. 다양한 면역세포들이 적절하게 영향을 주고받을 때 EAE가 유도되지만, 일반적으로 CD4 T cell의 비중이 매우 크다고 얘기합니다. 앞서 언급한대로 EAE를 유도하는 과정자체가 CFA라는 강한 면역반응을 유도할 수 있는 Adjuvant를 사용하는데, 이런 과정은 MOG peptide를 인식하는 CD4 T cell의 활성을 유도하고 상대적으로 CD8 T cell의 활성은 크게 유도하지 못하기 때문이며, MOG를 인식하는 CD4 T cell의 Adoptive transfer만으로도 EAE가 유도되기 때문입니다. 또한 CD4 T cell이 제대로 기능을 하지 않으면 EAE 유도자체가 되지 않습니다(Carr et al., 2017). 한 가지 극단적인 예를 들자면, MOG35-55 peptide를 이용한 일반적인 EAE의 경우 B cell이 존재하지 않아도 문제없이 EAE가 유도됩니다(Molnarfi et al., 2013). 하지만 실제로는 B cell과 B cell에 의해 만들어지는 항체가 MS의 발병과정에 연관이 있습니다(von Budingen et al., 2011). 따라서 이 부분만 보더라도 EAE가 완벽하게 MS의 병리학적 특성 및 기전을 재현한다고 할 수 없습니다. 이런 부분을 보완하고자 mouse MOG peptide 35-55를 이용하는 일반적인 EAE와 달리 recombinant human MOG를 이용하거나(Molnarfi et al., 2013) Myelin을 구성하는 또다른 단백질인 PLP를 이용해서(Boyden et al., 2020) B cell-dependent EAE 모델을 개발해 MS에서 B cell의 기능을 연구하기도 합니다. 이러한 한계점이 있음에도 불구하고 EAE는 자가면역질환에 기여하는 면역세포들의 성질 및 MS의 기전 이해에 큰 도움을 주고 있는 것이 사실입니다. 모델이 갖는 한계와 실제 질병과의 유사성을 먼저 이해하고 아는 것이 궁극적으로 질병의 이해 및 치료로 가는 길이기 때문에 EAE가 갖는 특징 및 한계점을 먼저 설명했습니다.   3. Active EAE   EAE 모델은 크게 Active EAE와 Passive EAE로 구분됩니다. 일반적으로 EAE라고 하면 Active EAE를 의미하는데, 뒤에서 설명할 Passive EAE와 구분짓기 위해 Active EAE라는 명칭을 사용합니다. Active EAE를 유도하기 위해서는 항원으로 사용될 MOG peptide와 CFA가 우선적으로 필요합니다. 항원으로 사용되는 MOG는 전체 단백질이 아닌 MOG peptide 35-55를 주로 사용합니다. CFA는 Complete Freund’s Adjuvant의 약자로 비활성화 또는 건조된 Mycobacteria (M. Tuberculosis)를 포함하는 기름성분이며, 강한 면역반응을 유도하기 위한 Adjuvant로 사용됩니다. 이론적으로는 자가항원에 반응하는 T cell들은 Negative selection에 의해 발생 단계에서 제거가 됩니다. 하지만 이 과정이 결코 완벽하지는 않고, 자가항원을 인식할 수 있는 T cell들이 실제로는 만들어져서 체내에 일부 존재하게 됩니다. 그럼에도 불구하고 이러한 Autoreactive T cell은 여러 경로를 통해 활성이 억제되기 때문에 실제로는 큰 문제를 일으키지 않습니다. 또한 이런 조절 매커니즘은 꽤나 효율적이어서 마우스에 MOG peptide만 주사한다고 해서 MOG peptide를 인식하는 Autoreactive T cell들이 활성화 되지 않습니다. 하지만 강한 염증반응이 유도될 때는 이야기가 달라집니다. 매우 강한 염증반응은 앞서 설명한 조절 메커니즘을 깨고 MOG 단백질을 인식하는 Autoreactive T cell들의 활성을 유도할 수 있습니다. 따라서 강한 면역반응을 유도할 수 있는 Adjuvant가 필요한데, 위에서 언급한 CFA가 해당 목적으로 사용됩니다. 강한 면역반응을 일으킴과 동시에 MOG peptide를 항원으로 제시하여 MOG를 인식하는 T cell의 활성화를 유도함으로써 중추신경계의 Myelin이 파괴되는 과정(Demyelination)을 유도하는 것이 EAE 모델의 기본 원리입니다 (그림 1). 하지만 이 과정이 그렇게 쉽지만은 않습니다. PBS에 MOG peptide를 넣어주고 CFA와 열심히 섞어줌으로써 물과 기름이 섞인 Emulsion을 만들어줘야 하는데, 두 개의 주사기 사이에 압력을 걸어 40분 정도 반복적으로 섞어줘야 하기 때문에 손가락과 손바닥이 꽤 아픈 고된 과정입니다. 추가적으로 Bordetella pertussis라는 박테리아가 만들어내는 Pertussis toxin(PTX)을 주사하는 과정이 필요합니다. PTX의 정확한 기능은 여전히 불분명하지만 Blood brain barrier(BBB)를 약화시키거나(Lu et al., 2008), T cell anergy 유도를 억제하거나(Kamradt et al., 1991) Treg cell의 기능을 약화시킴으로써(Chen et al., 2006) Immune tolerance를 무너뜨리는데 기여하거나, IL-1β생성을 증가시키는 기전(Dumas et al., 2014) 등을 통해 EAE 유도를 촉진시키는 것으로 이해되고 있습니다. PTX는 보통 두 번 (EAE를 유도한 당일과 1~3일 뒤 한 번 더) 주사합니다.   4. Passive EAE 앞서 소개한 Active EAE는 MOG peptide를 항원으로 직접 주사함으로써 마우스 안에 존재하는 MOG-specific T cell들의 활성을 유도하는 방법이지만, Passive EAE는 MOG를 인식하는 T cell만을 다른 마우스로 Adoptive transfer함으로써 이식된 T cell에 의해 EAE가 유도되도록 하는 방법입니다. 이러한 방법으로 유도된 EAE는 앞서 소개한 Active EAE와 구분하기 위해 Passive EAE 또는 Adoptive transfer EAE로 불립니다. Passive EAE는 Th1 cell 또는 pathogenic Th17 (pTh17) cell에 의해 두 가지 방법으로 유도될 수 있습니다. 또한 Th1 cell과 pTh17 cell의 출처에 따라 또다시 크게 두 가지의 방법으로 구분될 수 있습니다. 각 세포의 출처가 어떻게 다르며, 그에 따라 어떤 차이가 있는지 소개하도록 하겠습니다 (그림 2).   1) In vitro polarized-MOG-specific T cells 앞서 연재했던 TCR transgenic mouse를 소개하는 글에서 2D2 mouse를 소개했었습니다(Bettelli et al., 2003). 해당 마우스에서 얻는 CD4 T cell은 모두 MOG peptide 35-55를 인식하는 동일한 TCR을 발현합니다. 따라서 2D2 mouse에서 얻은 Naïve CD4 T cell을 Th1 cell 또는 pTh17 cell로 In vitro 분화시킨 후, 해당 세포를 다른 Recipient mouse로 Adoptive transfer해줌으로써 Passive EAE를 유도할 수 있습니다. 2D2 naive CD4 T cell을 Th1 cell 또는 pTh17 cell 분화 조건에서 5일동안 배양하고, 2 X 106 개정도의 세포를 IV 주사로 Adoptive transfer해주면 성공적으로 EAE가 유도됩니다. Th1 cell을 분화시키기 위해서는 IL-2, IFN-γ, α-IL-4 neutralizing antibody가 사용되며, pTh17 cell을 분화시키기 위해서는 IL-6, IL-1β, IL-23, α-IL-4 neutralizing antibody, α-IFN-γ neutralizing antibody가 사용됩니다. 흥미롭게도 pTh17 cell에 의해 유도된 passive EAE의 경우 일반적인 EAE에서 발견되는 증상과는 조금 다른 증상들이 나오는 Atypical EAE가 유도됩니다(Rangachari and Kuchroo, 2013). 해당 내용에 대해서는 다음 연재글에서 조금 더 다루도록 하겠습니다. In vitro 분화된 세포들은 실제로 몸 안에서 만들어지는 Th1 cell 또는 pTh17 cell과 차이는 존재할 수 있습니다. 하지만 동일한 조건에서 세포들을 배양할 수 있기 때문에 비교적 일관성 있는 데이터를 얻을 수 있는 장점이 있습니다. 2) Ex vivo expanded-MOG-specific T cells In vitro culture의 경우 2D2 naïve CD4 T cell을 얻어서 처음부터 pTh17 cell 또는 Th1 cell로 Cell culture dish에서 분화시킨 경우입니다. 하지만 이와 다르게 이미 Active EAE가 유도된 마우스에 존재하는 MOG-specific pTh17 cell 또는 Th1 cell을 이용하는 경우도 있습니다. 이 경우는 이미 체내에서 만들어진 Helper T cell subset의 양을 증식시키는 경우라서 (물론 Polarizing cytokine을 추가하지만) In vitro가 아닌 Ex vivo에 해당합니다. 이 방법으로 MOG-specific T cell을 얻는 과정은 조금 복잡합니다. 먼저 Donor 마우스에 Active EAE를 유도해야합니다. 그러면 자연스럽게 MOG를 인식하는 T cell들이 체내에서 분화 및 증식하게 됩니다. EAE를 유도하고서 7일 뒤에는 Spleen과 Lymph node에서 면역세포 전체를 얻어내고, MOG35-55 peptide와 Polarizing cytokine을 추가하여 3일정도를 추가적으로 배양하는 과정이 필요합니다. 이 과정에서 Antigen presenting cell에 의해 MOG peptide가 CD4 T cell에게 제시되고, MOG를 인식하는 CD4 T cell들이 선택적으로 증식하게 됩니다. 또한 추가적으로 넣어준 Polarizing cytokine에 의해 Th1 cell 또는 pTh17 cell의 분화가 유도됩니다. 이렇게 MOG를 인식하는 T cell의 숫자를 늘려준 후, CD4 T cell만을 재차 분리해주는 과정이 필요합니다. 이렇게 분리해서 얻은 CD4 T cell을 마찬가지로 Recipient mouse에 Adoptive transfer함으로써 Passive EAE가 유도됩니다. 이 방법의 경우 EAE가 유도된 마우스에서 얻은 CD4 T cell을 Ex vivo 배양을 통해 양을 늘린 경우라서 앞의 In vitro 배양보다는 실제 EAE 과정에서 만들어지는 Helper T cell subset과 더 유사하다는 장점이 있습니다. 하지만 필요한 세포를 얻기까지 꽤 오랜 시간이 필요하며 EAE 유도 및 Ex vivo 세포 배양에서 추가적인 비용이 발생한다는 단점이 있습니다. 또한 In vitro culture의 경우 비교적 순수한 Th1 cell 또는 pTh17 cell subset을 얻을 수 있으나, Ex vivo culture의 경우 다른 T helper cell subset과 분화되지 않은 CD4 T cell이 일부 섞이는 것이 불가피하기 때문에 온전히 Th1 cell 또는 pTh17 cell에 의한 Passive EAE라고 말할 수 없다는 한계점이 존재합니다. 게다가 WT과 특정 유전자가 KO된 세포를 이용해서 비교할 경우 두 그룹간 차이가 Donor 마우스에 존재하는 Th1 cell 또는 pTh17 cell의 비율 자체의 차이와 MOG에 반응하는 T cell의 Clone 차이에 기인할 수도 있다는 점에서 분석에 유의해야합니다.   5. EAE 연구를 통해 개발된 치료법: Natalizumab 비록 EAE가 MS를 완벽히 재현할 수는 없지만, EAE를 통해 발견된 면역학적 기전들은 새로운 MS 치료방법들을 제시하는 성과를 가져다 주었습니다. EAE를 통한 연구를 기반으로 개발된 MS 치료법들 중 대표적인 한 가지 경우를 소개하려고 합니다. Natalizumab은 세포의 이동에 필요한 Integrin의 기능을 억제하는 항체입니다. 구체적으로 Integrin α4β1에 결합하는 단클론항체이며, CD4 T cell이 혈관에서 염증조직으로 이동하는 과정을 저해합니다. 면역세포가 염증이 일어나는 조직으로 이동하기 위해서는 몇가지 일련의 과정들이 필요합니다. 면역세포는 기본적으로 혈액 내에서 순환하고 있습니다. 따라서 특정 위치로 가기위해서는 순환을 멈추고 혈관을 구성하는 Endothelial cell에 부착하는 과정이 선행되어야 하며, 이 과정에서 면역세포가 발현하는 Integrin α4β1이 Endothelial cell일 발현하는 VCAM-1과 결합하게 됩니다(Carman and Springer, 2004). Natalizumab은 이 과정에 필요한 Integrin α4β1이 다른 Ligands와 결합하는 것을 차단함으로써 CD4 T cell이 BBB를 통과하는 것을 막는 역할을 합니다. 이러한 사실은 EAE가 유도된 Rat의 Brain tissue section에 Lymphocyte를 반응시켜 Lymphocyte가 Brain tissue section에 부착되는 In vitro adhesion assay를 이용해 발견되었습니다(Yednock et al., 1992). 여러가지 Anti-integrin antibody중에서 Integrin α4에 결합하는 Antibody를 처리하였을 때 Lymphocyte가 Brain tissue section에 붙는 정도가 감소하는 것을 통해 해당 기전이 발견되었습니다. 이를 기초로 개발된 단클론항체인 Natalizumab은 2004년 미국 FDA의 승인을 얻어 MS 치료에 사용되고 있습니다(Steinman, 2012) (그림 3). 하지만 Natalizumab의 사용이 오히려 면역학적 방어에 필요한 Th1 cell을 감소시킴으로 인해 뇌에서의 JC virus의 기회감염을 일으키고, 결과적으로 Natalizumab을 장기간 사용할 경우 progressive multifocal leukoencephalopathy라는 질병에 취약해지는 부작용도 있습니다(Bloomgren et al., 2012). 또한 MS 발병 및 악화에 기여하는 Th17 cell의 경우 Integrin α4의 발현이 낮고, Natalizumab으로는 Th17 cell의 이동을 효과적으로 막기에는 어렵다는 제한점이 있습니다(Glatigny et al., 2011; Rothhammer et al., 2011; Schneider-Hohendorf et al., 2014).   6. 마치는 글 사람에게서 발생하는 면역 관련 질병들을 제대로 이해하고 치료방법을 제시하기 위해서는 실험 동물에서 유사한 질병을 재현하는 것이 필요합니다. 이러한 목적으로 MS 연구에 사용되고 있는 EAE라는 질병 모델에 대해 이론적인 부분을 중심으로 소개했습니다. 다음 연재에서는 EAE를 통해 얻을 수 있는 데이터와 EAE를 이용한 연구를 함에 있어서 필요한 실제적인 팁들을 소개하도록 하겠습니다. 자가면역질환을 연구하고있는 대학원생들이 이번 연재를 통해 EAE라는 질병 모델에 대한 이해가 확장되었기를 바라며 이번 글을 마무리 짓겠습니다. References Bettelli, E., Pagany, M., Weiner, H.L., Linington, C., Sobel, R.A., and Kuchroo, V.K. (2003). Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific T cell receptor transgenic mice develop spontaneous autoimmune optic neuritis. J Exp Med 197, 1073-1081. Bloomgren, G., Richman, S., Hotermans, C., Subramanyam, M., Goelz, S., Natarajan, A., Lee, S., Plavina, T., Scanlon, J.V., Sandrock, A., et al. (2012). Risk of natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy. N Engl J Med 366, 1870-1880. Boyden, A.W., Brate, A.A., and Karandikar, N.J. (2020). Novel B cell-dependent multiple sclerosis model using extracellular domains of myelin proteolipid protein. Sci Rep 10, 5011. Carman, C.V., and Springer, T.A. (2004). A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Biol 167, 377-388. Carr, T.M., Wheaton, J.D., Houtz, G.M., and Ciofani, M. (2017). 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Pertussis toxin prevents the induction of peripheral T cell anergy and enhances the T cell response to an encephalitogenic peptide of myelin basic protein. J Immunol 147, 3296-3302. Kerlero de Rosbo, N., Milo, R., Lees, M.B., Burger, D., Bernard, C.C., and Ben-Nun, A. (1993). Reactivity to myelin antigens in multiple sclerosis. Peripheral blood lymphocytes respond predominantly to myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Clin Invest 92, 2602-2608. Lassmann, H., and Bradl, M. (2017). Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathol 133, 223-244. Lu, C., Pelech, S., Zhang, H., Bond, J., Spach, K., Noubade, R., Blankenhorn, E.P., and Teuscher, C. (2008). Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. J Neurosci Res 86, 2624-2640. Molnarfi, N., Schulze-Topphoff, U., Weber, M.S., Patarroyo, J.C., Prod'homme, T., Varrin-Doyer, M., Shetty, A., Linington, C., Slavin, A.J., Hidalgo, J., et al. (2013). MHC class II-dependent B cell APC function is required for induction of CNS autoimmunity independent of myelin-specific antibodies. J Exp Med 210, 2921-2937. Rangachari, M., and Kuchroo, V.K. (2013). Using EAE to better understand principles of immune function and autoimmune pathology. J Autoimmun 45, 31-39. Rothhammer, V., Heink, S., Petermann, F., Srivastava, R., Claussen, M.C., Hemmer, B., and Korn, T. (2011). Th17 lymphocytes traffic to the central nervous system independently of alpha4 integrin expression during EAE. J Exp Med 208, 2465-2476. Schneider-Hohendorf, T., Rossaint, J., Mohan, H., Boning, D., Breuer, J., Kuhlmann, T., Gross, C.C., Flanagan, K., Sorokin, L., Vestweber, D., et al. (2014). VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med 211, 1833-1846. Steinman, L. (2012). The discovery of natalizumab, a potent therapeutic for multiple sclerosis. J Cell Biol 199, 413-416. von Budingen, H.C., Bar-Or, A., and Zamvil, S.S. (2011). B cells in multiple sclerosis: connecting the dots. Curr Opin Immunol 23, 713-720. Yednock, T.A., Cannon, C., Fritz, L.C., Sanchez-Madrid, F., Steinman, L., and Karin, N. (1992). Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin. Nature 356, 63-66.      
박은총  |  2020.09.18
Q. 논문 검색방법을 찾고 싶습니다
myeloma도 mAb를 생산하는 것으로 알고 있습니다마는, 이를 plasma cell과 fusion시켜 hybridoma 형성하여 mAb를 형성하는 방법 이외에 특정 plasma cell을 myeloma로 유도시켜 mAb를 생산할 수 있는 방법이 있을까요? 또 이에 대한 논문의 검색법을 알고 싶습니다ㅠㅠ 현재 고등학생이다보니 쉽지 않네요
회원작성글 Cephe1d  |  2020.09.12
Q. 점막 면역학 mucosal immunology 에 대한 책이나 논문 추천 부탁드립니다.
안녕하세요. 장내미생물을 연구하다가 장내 점막환경과 면역이 밀접한 관련이 있다는 점이 흥미가 있어 점막 면역학과 장내미생물 연구를 연결하여 공부하려고 합니다.   혹시 점막면역의 기본을 공부하기 위한 책이나 논문이 있을까요? 일반 면역학에 해당 내용이 좀 언급이 되어 있는지요?   아니면 점막에 대하여 깊이 있게 공부하려면 화공과 등에서 배우는 계면공학 관련 서적 중에 단초가 될 만한 책이 있을까요? 감사합니다.        
회원작성글 밝음지혜  |  2020.09.08
Q. balf에서 대식세포, 림프구, 중성구, 호산구 cell counting
천식 mouse balf에서 면역세포 counting하려고합니다. 어떤 염색약을 사용해야하는지 업체에 맡겨야하는지 아시는분있으신가요 그냥 cell counting하는 방법처럼  현미경으로 세는것이 맞는지 알려주세요ㅠㅠ
회원작성글 우니이이아이  |  2020.09.06
Q. 특정인터페론이 증가하면 다른인터페론은 감소하게 되나요?
사이토카인의 총량보존의 법칙같은 것이 있어서 특정인터페론이 증가하면 다른인터페론은 감소하게 되나요?   이러한 내용으로 쓰여진 논문을 알고계시면 알려주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 dltmf  |  2020.09.04
Q. IHC background 질문드립니다. 첨부파일
IHC 실험하다가 background 떄문에 질문드립니다.   일반적인 protocol로 진행중이고,  blcoking, 1st antibody, 2nd antibody, ABC, DAB  매 step마다 1x PBS 5min 씩 2번 washing 을 하는데요.   Dehydration다하고 mounting 할때보면  사진에서 처럼  주변에 얼룩이 생김이나 잘 안보일수도있는데 연한 갈색으로요.   문제가 뭘까요.. 전 실험실에서 진행할때는 문제없이 진행했엇거든요. 실험실 옮기고 차이라고 하면 ABC step추가 뿐인데. IHC 고수님들 도움 요청드립니다.
회원작성글 아기새  |  2020.08.28
Q. ELISA와 western blot의 차이
안녕하세요.  염증성 사이토카인(IL-1베타,TNF-알파,IL-6)과 NF-kB(p65, p-p65), HO-1을 확인해보려고하는데, 염증성 사이토카인은 ELISA로 하는 것으로 정했지만, NF-kB와 HO-1은 대부분의 선행논문에서 western 으로 실험을 진행하여서, western blot으로 하려고했습니다. 그런데, elisa와 western blot 모두 immunobloting인 것으로 알고 있는데, 논문에 보면 p65와 HO-1은 주로 western blot으로 실험을 진행하였는데, 이러한 이유에 대해서 알고 싶습니다.  이전 브릭 답변을 보면 세포내 발현되는 단백질의 경우에는 cell을 부셔서, 그것을 정량해서 western blot을 한다고 하는데, 제 좁은 식견으로는 ㅠㅠ 전염증성 사이토카인도 핵 내 NF-kB에서 발현되어서 어떻게 보면 세포내 발현되는 것 아닌가요? 사이토카인은 western 시 농축문제 때문에 ELISA를 한다는 글은 봤는데, 그렇다면 p65, HO-1도 ELISA로 해도 문제가 없는것인가요? 그리고 염증을 다룬 sci논문들에서 대부분 NF-kB는 western 으로 실험을 진행한 이유를 알고싶습니다.   
회원작성글 ehqlehqleh..  |  2020.08.25
Q. balb/c nude mouse mating 관련 질문있습니다!!!!
제가 실수로 Balb/c nude mouse 수컷과 암컷을 하루동안 같이 넣어놨는데 얘네가 mating 했을 확률이 높을까요?ㅜㅜㅜㅜㅜㅜㅜㅜㅜ
회원작성글 박사를할까말까  |  2020.08.23
Q. B16F10, C57Bl/6 BALB/c 읽는 방법이 궁금합니다.
논문을 처음 읽어보는데, B16F10 tumor cells 과  C57Bl/6 BALB/c 위에 두개는 쥐인거 까지 알겠는데 읽는 방법이 궁금합니다!    감사합니다
회원작성글 ykown  |  2020.08.23
Q. Western blot에서 같은 문제가 계속 나타나서 몇개월 째 실험결과를 못내고 있습니다.
안녕하세요 현재 면역학 실험실에서 석사 1학기 다니고 있는 대학원생 입니다. 다름이 아니고 몇 개월 째 같은 문제가 일어나서 실험결과를 제대로 못내고 있는 것으로 인해 조언을 구하고 싶습니다. Western blot할 때 몇 개월째 계속 같은 이유로 결과를 못내고 있습니다. Detection하고 결과를 보면 항상 band가 끝까지 나오질 않습니다.  pAktβ-actin COX-2β-actin 첨부한 이미지 처럼 결과를 보면 band가 모든 sample에서 다 나오는 것이 아니라 오른쪽 아니면 왼쪽 부분이 아예 나오지를 않습니다. 나오지 않는 단백질도 이미지처럼 pAkt일 때도 있고 β-actin일 때도 있습니다. 이 뿐만이 아니라 COX-2, COX-1, Akt 등등 나오지 않는 단백질도 다양합니다. 나오지 않는 부분도 오른쪽, 왼쪽, 가운데 등등 때에 따라 다르지만 주로 오른쪽이 나오지를 않습니다. ECL 용약과 반응시켰을 때를 보면 신호가 강한 β-actin의 경우는 암실에서 눈으로도 보이는데 이 때도 저런 식으로 한쪽에서만 빛이 보이지 않을 때가 있고, 역시 필름으로 찍어보면 나오지를 않습니다. 그 부분만 필름을 대고 오래찍어봐도 아무것도 나오지 않고요..SDS-PAGE나 유도가 안 된 문제라고 생각하기에는 폰슈로 확인했을 때 transfer는 아주 잘 된 것으로 나오고, reproving하고 다시 항체를 붙여서 필름으로 찍으면 그 때는 이런 현상이 나오지 않고 다 잘 나옵니다. 또 같은 크기의 분자롤 reproving한 뒤에 찍었을 때도 잘 나옵니다.( 물론 그렇기 않을 때도 있긴 하지만 대게 잘 나옵니다.) ECL 용액과 반응시키는 방법이라던가, developer, fixer의 문제도 아니거니와 reagent(항체, TTBS, blocking solution, ECL, developer, fixer 등)의 문제도 아닌 것이, 이러한 reagent들은 같이 사용하고 있는데 저에게만 이런 문제가 나타납니다. Protocol도 마찬가지로 같은 방법을 사용하기 때문에 문제가 없습니다. 여러가지를 테스트 해보았지만 아무것도 바뀌는 것이 없었고, 그나마 달라지는 것은 보통은 먼저 찍은 membrane의 경우가 대체적으로 잘 나오고 나중에 찍는 membrane에서 이런 문제가 나타난 것입니다. 테스트 해볼 것도 다 해봤고, 더 이상은 짚이는 게 없습니다. 한 쪽이 아예 아무것도 나오지 않고 ECL과 반응조차도 하지 않을 정도로 제가 치명적인 실수를 했는지도 짐작 조차도 되지 않아서..저희 실험실에서 이런 문제가 나타난 것이 제가 처음이어서 같이 계시는 박사님께서도 이유를 모르겠다고 하십니다. 처음 이런 현상이 나왔을 때는 격주에 한 번씩 이었지만 최근 3개원 정도는 매주 데이터가 나올 때마다 이러한 문제가 나타납니다. <Protocol> 1.SDS-PAGE 후 transfer 2.Transfer 끝난 후 0.1% TTBS로 10min wash 3. Blocking 3% skim milk 1h RT shaker rpm80 에서  4. Primary antibody COX-2: 1:4,000, in 3% BSA, 4°C, overnight                           pAkt: 1:2,000 in 3% skim milk, 4°C, overnight                           β-actin: 1:200,000 in 3% skim milk, 4°C, overnight 5. Primary wash 0.1% TTBS 10min x 3 6. Secondary antibody: anti-Mouse or rabbit 1:5,000 RT, 1h shaker rpm 80 7. Secondary wash 0.1% TTBS 10min x 3 혹시 브릭에 계신 분들 중 저 같은 문제를 겪으신 분이 있는지 궁금해서 이렇게 여쭈어 봅니다. 이런 문제가 왜 일어나는지 아시는 분이 계시다면 조언 부탁드리겠습니다.. 
회원작성글 생밀레  |  2020.08.21
Q. lympocyte stimulation
안녕하세요 석사과정 대학원생입니다. 닭에서 splenocyte 분리 및 blood에서 PBMC 분리를 통해 flow cytometry방법과 cell 항원 자극을 통해 CD4, CD8을 확인하고 cytokine을 확인하는 실험을 하고 있습니다. cell 을 분화시켜 cytotoxic t cell과 helper t cell 로 얼마나 가는지 확인하고 싶은데 사실 면역학 쪽과 cell 키우는 것에 깊은 지식이 없어서 좋은 데이터가 나오지 않나 싶습니다. 또한 cell이 분화하는 과정에서 cytokine이 분비되는 것도 비례하게 많이 나올거라 생각하는데 참고할 만한 자료나 논문을 잘 모르겠더라구요.. 지금까진 IL-2를 넣지않았는데 다른 실험실에서 IL-2는 꼭 넣어줘야하는 물질이라고 하더라구요. 위의 실험 관련해서 IL-2가 필요한지 여부나 필요하다면 이유도 조금 설명해주실수 있는지 여기에 여쭤보고 싶습니다. 감사합니다.
회원작성글 왕왕왕  |  2020.08.20
프로토콜 [연재][후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트] #4_TCR transgenic mouse
* 본 글은 "BRIC Bio통신원의 연재"에 올려진 동일한 제목의 컨텐츠를 "프로토콜"에서도 소개하기 위해 동일한 내용으로 올렸습니다(클릭시 연재글로 이동).     면역학 연구에서 사용되는 마우스를 소개하는 글로 첫 연재를 시작했습니다. 어느덧 네 번째 글을 적게 되었는데, 이번에도 면역한 연구에서 사용되는 마우스에 관한 소개를 하려고 합니다.   1. 들어가는 글: 몸 안의 면역세포가 한 가지의 항원만을 인식할 수 있을까? 면역체계를 구성하는 세포들은 그 종류와 기능이 매우 다양합니다. 선천성면역(Innate immunity)을 담당하는 세포들의 경우 일반적으로 병원체가 갖는 특정한 패턴(PAMP: pathogen associated molecular pattern)을 인식하는 수용체들을 가지고 있습니다. 예를들면 LPS에 반응하는 TLR4와 같은 것이 있습니다. 반면 후천성면역(Adoptive immunity)을 구성하는 B cell과 T cell의 경우 특정한 단백질 또는 펩타이드만을 선택적으로 인식할 수 있는 정교한 수용체들을 가집니다. 이중에서 B cell이 발현하는 BCR(B cell receptor)이 세포에서 떨어져 나간 것이 다양한 실험에 사용되는 항체(Antibody)입니다. T cell은 이와 비슷하게 TCR(T cell receptor)을 발현하는데 BCR과는 여러가지 차이점들이 있습니다 (그 차이들에 대해서는 이 글에서는 다루지 않겠습니다). 이중에서 TCR에 대한 이야기를 해보려고합니다. T cell은 TCR을 통해 특정 Peptide를 인식함으로써 세포 활성화가 일어나며, 이를통해 세포분열 및 세포분화가 발생합니다. 이러한 T cell을 연구하려면 결국 내가 원하는 T cell을 활성화시킬 수 있는 방법이 필요합니다. 그러나 이론적으로 1015 ~ 1020가지의 서로다른 종류의 TCR을 갖는 T cell들이 만들어질 수 있으며, 실제 사람의 몸에는 1013가지의 서로다른 TCR을 갖는 T cell clone이 존재합니다(Bianconi et al., 2013). 따라서 내가 관심을 갖는 물질(항원)을 인식하고 활성화될 수 있는 T cell은 체내에 매우 적은 양이 존재하고, 이러한 사실은 결국 In vivo T cell 연구에 한계를 가져오게 됩니다. 하지만 체내의 모든 T cell들이 똑같은 TCR을 가질 수 있다면 어떨까요? 원하는 항원에만 반응하는 T cell만을 만드는 쥐가 있다면 어떨까요? 만약 이런 시스템을 구현할 수 있다면, 모든 T cell 반응을 한 가지 항원에 대한 반응으로 동기화 시킴으로써 항원 특이적 TCR 활성에 따른 T cell의 반응을 효율적으로 연구할 수 있을 것입니다. 이러한 목적을 가지고 개발된 마우스들을 TCR transgenic mouse라고 합니다. 이번 연재에서는 면역학 연구에서 사용되는 TCR transgenic mouse들을 몇가지 소개하고 그 안에 적용된 면역학적 이론들을 설명하려고 합니다.   2. OT-II mouse OT-II mouse는 면역학 연구에서 사용되는 TCR transgenic mice 중에서 매우 널리 사용되는 마우스입니다. 이 마우스는 Chicken ovalbumin(OVA) 323-339 peptide를 특이적으로 인식하는 CD4 T cell을 만들어냅니다(Barnden et al., 1998). 일반적인 마우스에서는 CD4 T cell과 CD8 T cell이 비슷한 양으로 만들어지지만 (CD4 T cell이 조금 더 많기는 합니다만), OT-II mouse의 경우 대부분의 T cell이 CD4 T cell로 구성되고, CD8 T cell은 매우 적습니다. 앞서 설명한대로 OT-II mouse에서 발견되는 CD4 T cell은 OVA323-339 peptide에 특이적으로 반응하지만, 적게나마 만들어지는 CD8 T cell은 OVA peptide에 특이적인 TCR을 갖지 않습니다. 이러한 현상이 나타나는 이유는 이후에 다루도록 하겠습니다. OT-II mouse의 CD4 T cell은 모두 (엄격하게 말하자면 100%는 아니지만) OVA323-339 peptide를 인식하기 때문에 OVA를 이용한 CD4 T cell의 in vivo연구에 이 마우스를 사용할 수 있습니다. OT-II mouse로부터 분리해낸 OT-II CD4 T cell을 다른 수여자 마우스에 Adoptive transfer하고 수여자 마우스에 OVA peptide를 주사하여 면역반응을 유도함으로써 OT-II CD4 T cell이 체내에서 어떤 반응을 보이는지 연구할 수 있습니다. 예를 들어 그림 1의 경우처럼 Bcl6 유전자가 Follicular helper T cell의 분화에 어떤 역할을 갖는지를 알기 위해 OT-II mouse로 부터 얻은 CD4 T cell을 사용할 수 있습니다 (그림 1).   2. OT-I mouse OT-I mouse가 OT-II mouse와 이름이 비슷한데는 이유가 있습니다. OT-II mouse와 비슷하게 Chicken OVA에 특이적인 T cell을 갖는 마우스이기 때문입니다. 하지만 OT-II mouse와는 다르게 다르게 OVA 257-264 peptide에 특이적으로 결합하는 CD8 T cell을 갖습니다(Hogquist et al., 1994). OT-II mouse와는 반대로 CD4 T cell은 거의 없고 CD8 T cell이 대부분입니다. 또한 아주 조금 존재하는 CD4 T cell은 OVA를 인식하지 않습니다. 마우스가 만들어진 순서로 보면 OT-II mouse보다 OT-I mouse가 먼저 만들어졌습니다. 만들어진 순서 때문에 이름에 숫자 1과 2에 해당하는 로마 숫자가 붙은 것은 아닙니다. 먼저 만들어진 OT-I mouse의 경우 Ova-tcr-I mouse를 줄여서 표기한 것입니다(Hogquist et al., 1994; Kelly et al., 1993). 뒤에 붙은 로마 숫자 I은 MHC class I에 의해 제시되는 OVA peptide를 CD8 T cell이 인식하기 때문에 붙은 이름입니다. OT-II도 비슷한 방식으로 이름이 붙은 것이며, OT-I과는 반대로 T cell이 MHC class II에 의해 제시되는 OVA peptide를 인식하기 때문에 뒤에 로마 숫자 II가 붙은 것입니다. OT-I mouse는 OVA 특이적인 CD8 T cell을 갖기 때문에 Memory CD8 T cell을 연구하거나 CD8 T cell에 의한 종양 제거를 연구하는 등 다양한 연구에 사용될 수 있습니다.    3. HY-TCR transgenic mouse 세 번째로 소개할 TCR transgenic mouse는 조금 생소할 수도 있지만 이 마우스가 갖는 의미가 크기 때문에 소개하려고 합니다. 이 마우스는 가장 처음으로 만들어진 TCR transgenic mouse이며, T cell의 발생과정중에 체내에서 발현되는 단백질(자가항원)을 인식하는 T cell은 Negative selection을 통해 제거됨을 밝히는데 사용된 마우스입니다 (Kisielow et al., 1988). 남성은 여성과 다르게 Y 염색체를 가지며, 이로 인해 여성에게는 없는 단백질을 만들게 됩니다. Y 염색체로부터 만들어지는 수많은 단백질 중에 여성에게서 면역거부 반응을 일으키는 항원을 HY antigen이라고 명명합니다. HY antigen을 인식하는 TCR을 갖는 CD8 T cell을 만들어내는 마우스가 바로 HY-TCR transgenic mouse입니다. 위에서 인용한 논문(Kisielow et al., 1988)에서는 HY-TCR transgenic mouse의 성별이 수컷일 경우 Thymus에서 Double positive (CD4+ CD8+) thymocytes의 숫자가 감소하는 것을 확인했고, 이를 통해 스스로를 공격할 가능성이 있는 Autoreactive T cell은 Double positive stage에서 제거되는 Negative selection이 존재함이 증명되었습니다 (그림 2). 이처럼 TCR transgenic mouse의 개발은 면역체계가 어떻게 Immune tolerance를 구축하는지에 대한 이해를 가능케하였습니다.   4. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific (2D2) TCR transgenic mouse 마지막으로 소개할 TCR transgenic mouse는 2D2 TCR transgenic mouse로 불리는 마우스로 다발성 경화증(Multiple sclerosis)연구에 널리 사용되는 마우스입니다. 2D2라는 이름은 마우스를 만드는데 사용된 T cell clone 이름입니다(Bettelli et al., 2003). 다발성 경화증의 동물모델인 EAE는 Myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG)라는 Myelin sheath를 구성하는 단백질을 인식하는 CD4 T cell에 의해 발병하는 자가면역질환 모델입니다. 따라서 EAE를 유도하기 위해서는 마우스에 MOG 35-55 peptide 와 함께 CFA를 피하주사함으로써 강한 면역반응을 유도하고, 이를통해 MOG peptide를 인식하는 T cell이 Immune tolerance를 깨고 Th17 cell과 Th1 cell로 분화되도록 하는 과정이 필요합니다. 반면 2D2 mouse는 이미 MOG35-55 peptide에 특이적인 TCR을 갖는 CD4 T cell을 처음부터 갖도록 만들어진 마우스입니다 (Bettelli et al., 2003). 2D2 mouse는 MOG35-55 peptide 특이적인 CD4 T cell만을 만들며, CD8 T cell은 거의 존재하지 않습니다. 또한 일부 존재하는 CD8 T cell은 MOG 특이적인 TCR을 갖지 않습니다. 일반적인 EAE와는 다르게, 2D2 mouse 에서 분리한 naive CD4 T cell을 분화시켜 만든 Th1 cell이나 pathogenic Th17 cell을 다른 수여자 마우스에 IV 주사함으로써 EAE를 유도할 수 있습니다. 이러한 방법을 Passive EAE 또는 Induced EAE라고 부르며, 이에 대한 내용은 이후 연재에서 조금 더 자세하게 다루도록 하겠습니다. 2D2 mouse는 이미 MOG-specific CD4 T cell을 가지고 있기 때문에, 비록 낮은 비율이지만, EAE나 Opticneuritis와 같은 자가면역질환이 2D2 mouse에서 자연적으로 발생하기도 합니다 (Bettelli et al., 2003). 저도 동물실에서 2D2 mouse를 관리하고 있는데, 아주 낮은 비율로 2D2 mouse에서 가끔 EAE가 발병하는 경우를 보곤합니다.   5. TCR transgenic mouse가 갖는 특징에 대한 이해 앞서 설명한 TCR transgenic mouse들의 경우 특이한 특징을 갖습니다. CD4 T cell 또는 CD8 T cell 중에서 한가지 종류의 T cell이 다른 T cell보다 많이 만들어진다는 것입니다. OT-II mouse나 2D2 mouse의 경우 CD4 T cell이 압도적으로 많고, OT-I mouse나 HY-TCR transgenic mouse의 경우 CD8 T cell이 대부분을 차지합니다. 왜 이런 현상이 일어나는지 이해하기 위해서는 T cell의 발달과정과 TCR transgenic mouse를 만드는 과정에 대한 이해가 필요합니다. 우선 T cell의 발달과정에 대해 간략히 설명하도록 하겠습니다. T cell은 크게 αβ T cell과 γδ T cell로 나눌 수 있는데, 이번 글에서 얘기하고 있는 CD4 T cell과 CD8 T cell은 TCR이 α chain과 β chain으로 이루어져 있기 때문에 αβT cell에 속합니다. αβ T cell이 Thymus에서 만들어질 때 VDJ recombination이라는 과정을 통해 무작위적인 서열의 β chain과 α chain의 TCR이 만들어집니다. 그런데 이렇게 무작위적인 서열을 갖는 TCR을 만드는 과정에서 기능상에 문제가 있는 TCR이 매우 많이 만들어지고, 이런 TCR을 갖는 T cell들은 Positive selection과 Negative selection 과정을 통해 제거됩니다. 이런 이유로 Thymus에서 만들어지는 T cell의 대부분은 죽고, 오직 일부의 정상적인 TCR을 갖는 T cell만 살아남게 됩니다. 하지만 TCR transgenic mouse가 갖는 T cell에는 이미 제대로된 기능을 하는 TCR을 만들 수 있는 DNA가 삽입되어있기 때문에 해당 TCR을 발현하는 T cell은 Positive selection과 Negative selection 모두를 쉽게 통과하게 되고 죽지 않게 됩니다. 결국 TCR transgenic mouse에서 만들어지는 αβT cell은 대부분이 (이론적으로는 100%) Transgenic TCR을 갖는 한 종류의 T cell로 발달되게 됩니다. 그런데 OT-II mouse에서 일부 발생하는 CD8 T cell은 왜 OVA에 반응하지 않으며 반대로 OT-I mouse에서 일부 발생하는 CD4 T cell은 왜 OVA에 반응하지 않는지 의문이 생깁니다. 이부분을 이해하려면 T cell 발달과정중에 일어나는 Positive selection에 대한 이해가 필요합니다 (그림 3). T cell에서 만들어진 TCR은 MHC class I 또는 MHC class II중 하나에 어느정도 결합할 수 있어야만 TCR로서 기능을 할 수 있습니다. 이것을 확인하는 과정이 Positive selection입니다. 어떤 TCR이 MHC class I에 더 강하게 결합하면 이 TCR을 발현하는 T cell은 CD8 T cell로 발달되고, 어떤 TCR이 반대로 MHC class II에 더 강하게 결합한다면 이 TCR을 발현하는 T cell은 CD4 T cell로 발달되게 됩니다(Wang and Bosselut, 2009).   TCR transgenic mouse를 만들 때 이용하는 TCR의 DNA sequence는 인위적으로 만드는 것이 아니라 실제 마우스에서 얻은 CD4 T cell 또는 CD8 T cell 중에서 골라내는 것입니다 (그림 4). 따라서 OT-II mouse의 경우 OVA에 반응하는 CD4 T cell에서 TCR의 DNA sequence를 얻어낸 것입니다. 해당 TCR이 CD4 T cell에서 유래했다는 것은 해당 TCR이 Positive selection 과정에서 MHC class II에 반응했다는 것이며, 결과적으로 TCR transgenic mouse의 CD4 T cell이 해당 TCR을 발현하면 자연스럽게 Positive selection 과정중에 CD4 T cell로 발달하게 됩니다. 이런 이유로 OT-II mouse에서 OVA에 반응하는 TCR을 발현하는 T cell이라면 해당 T cell은 CD4 T cell이 될 수밖에 없습니다. 결국 일부 발견되는 CD8 T cell은 Transgenic TCR이 아닌 다른 TCR을 갖고 있다는 말이 됩니다. 이는 OT-I mouse나 2D2 mouse 등 다른 TCR transgenic mouse에서도 동일하게 적용되는 원리입니다. 이론적으로는 모든 T cell이 Transgenic TCR을 발현해야하고 한 종류의 (CD4 또는 CD8) T cell만이 만들어져야합니다. 그러나 실제로는 Transgenic TCR이 아닌 다른 Endogenous TCR을 발현하는 T cell들이 발견됩니다. 이런 현상은 Allelic exclusion이라는 과정에서 발생하는 결함입니다. 간단하게 설명해보자면 이미 TCR을 만든 T cell에서는 또다른 TCR이 만들어지지 않게 되는데, 이러한 과정을 Allelic exclusion이라고 합니다. 그러나 이 과정은 늘 이론처럼 완벽하지는 않아서 Transgenic TCR이 아닌 다른 TCR을 만드는 결과를 낳습니다(Bluthmann et al., 1988). 그렇기 때문에 OT-II mouse나 2D2 mouse에서는 CD8 T cell이 적게나마 발견되는 것이며, OT-I mouse나 HY-TCR transgenic mouse에서는 적게나마 CD4 T cell이 발견됩니다. 앞서 설명한 원리에 의해 이렇게 적게 존재하는 CD8 T cell 또는 CD4 T cell은 Transgenic TCR을 발현하지 않습니다. 다르게 얘기하자면 Transgenic TCR을 발현하지 않기 때문에 CD8 T cell 또는 CD4 T cell이 된 것입니다. 그러나 Allelic exclusion이 완벽하지 않다는 것은 동일한 CD4 T cell 또는 CD8 T cell에서도 Transgenic TCR이 아닌 Endogenous TCR을 가질 수 있음을 의미합니다. 그러므로 이론과는 다르게 OT-II mouse에서 만들어지는 CD4 T cell 중에서 아주 일부는 OVA에 반응하지 않으며, OT-I mouse에서 만들어지는 CD8 T cell 중에서도 아주 일부는 OVA에 반응하지 않습니다. 이런 부작용을 없애기 위해 TCR recombination 기능이 상실된 Rag1 KO mouse나 Rag2 KO mouse를 Backoground로 TCR transgenic mouse를 만들기도 합니다. 이렇게 되면 T cell은 Endogenous TCR을 만들 수 있는 기능을 상실하기 때문에 Transgenic TCR밖에 발현할 수 없게 됩니다. 그러나 이것마저도 (Rag1 또는 Rag2 둘 중 하나만 가지고도) 아주 일부의 T cell이 Transgenic TCR대신 Endogenous TCR을 발현합니다(Montaudouin et al., 2010). 하지만 이정도는 대부분의 경우 무시할 만한 수준이기 때문에 대부분의 경우 크게 고려하지 않는 부분입니다.   6. 마치는 글 연구에 사용되는 마우스들의 종류는 참 다양합니다. 그러나 정작 그 마우스가 어떻게 만들어졌으며 그 과정에 어떤 이론적인 내용들이 있는지를 모르고 넘어가는 경우가 참 많습니다. 저도 처음 OT-II mouse를 접하게 되었을 때 왜 CD4 T cell만 OVA에 반응하는지 의문이 들었습니다. 왜 굳이 OT-I mouse와 OT-II mouse가 따로 있는지 이해가 되지 않던 때가 있습니다. 아마 저와 같은 궁금증을 갖고있는 새내기 연구자들에게는 이번 글이 해답을 주었으리라 기대해봅니다. 이번에 소개한 네 종류의 TCR Transgenic mouse말고도 더 다양한 종류의 TCR transgenic mouse가 있습니다. 또한 TCR 뿐만 아니라 BCR(B cell receptor) transgenic mouse도 존재합니다. 이러한 다양한 마우스의 개발이 면역학 연구에 매우 큰 업적을 남기게 되었습니다. 앞으로 어떤 종류의 TCR transgenic mouse들이 개발이 될지, 그리고 TCR transgenic mouse를 통해 어떤 새로운 연구들이 가능하게 될지가 매우 기대가 됩니다. 마우스를 이용해서 연구를 하고있는 대학원생들이 저의 글을 통해 마우스에 대한 이해도가 조금이라도 확장되었기를 바라며 이번 글을 마무리 짓겠습니다.   References Barnden, M.J., Allison, J., Heath, W.R., and Carbone, F.R. (1998). Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunol Cell Biol 76, 34-40. Bettelli, E., Pagany, M., Weiner, H.L., Linington, C., Sobel, R.A., and Kuchroo, V.K. (2003). Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific T cell receptor transgenic mice develop spontaneous autoimmune optic neuritis. J Exp Med 197, 1073-1081. Bianconi, E., Piovesan, A., Facchin, F., Beraudi, A., Casadei, R., Frabetti, F., Vitale, L., Pelleri, M.C., Tassani, S., Piva, F., et al. (2013). An estimation of the number of cells in the human body. Ann Hum Biol 40, 463-471. Bluthmann, H., Kisielow, P., Uematsu, Y., Malissen, M., Krimpenfort, P., Berns, A., von Boehmer, H., and Steinmetz, M. (1988). T-cell-specific deletion of T-cell receptor transgenes allows functional rearrangement of endogenous alpha- and beta-genes. Nature 334, 156-159. Hogquist, K.A., Jameson, S.C., Heath, W.R., Howard, J.L., Bevan, M.J., and Carbone, F.R. (1994). T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell 76, 17-27. Kelly, J.M., Sterry, S.J., Cose, S., Turner, S.J., Fecondo, J., Rodda, S., Fink, P.J., and Carbone, F.R. (1993). Identification of conserved T cell receptor CDR3 residues contacting known exposed peptide side chains from a major histocompatibility complex class I-bound determinant. Eur J Immunol 23, 3318-3326. Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U.D., Steinmetz, M., and von Boehmer, H. (1988). Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature 333, 742-746. Montaudouin, C., Boucontet, L., Mailhe-Lembezat, M.P., Mariotti-Ferrandiz, M.E., Louise, A., Six, A., Freitas, A.A., and Garcia, S. (2010). Endogenous TCR recombination in TCR Tg single RAG-deficient mice uncovered by robust in vivo T cell activation and selection. PLoS One 5, e10238. Wang, L., and Bosselut, R. (2009). CD4-CD8 lineage differentiation: Thpok-ing into the nucleus. J Immunol 183, 2903-2910.          
박은총  |  2020.08.13
프로토콜 [연재][후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트] #3_Flow Cytometry_실무
* 본 글은 "BRIC Bio통신원의 연재"에 올려진 동일한 제목의 컨텐츠를 "프로토콜"에서도 소개하기 위해 동일한 내용으로 올렸습니다(클릭시 연재글로 이동).     지난 연재에서는 Flow cytometry가 어떤 것인지에 대한 이론적인 설명들을 주로 다뤘다면, 이번 연재에서는 Flow cytometry를 이용한 실험에 실질적으로 도움이 될만한 내용들을 다루고자 합니다. 바로 본론으로 들어가도록 하겠습니다.   1. Cell culture가 제대로 되어야 한다: Media 색 변화 Flow cytometry를 이용하는 가장 일반적이고 주된 목적은 형광항체를 활용해 단백질 발현을 측정하는 것입니다. 결국 단백질이 제대로 발현되어야 제대로 분석을 할 수 있습니다. 당연한 말이지만, 새내기 대학원생들이 이 부분을 간과하는 것을 종종 보게 됩니다. 결론부터 얘기를 하자면 세포를 키운 Media의 색이 노랗게 되면 십중팔구는 제대로 된 결과를 얻기 어렵습니다.     왜 Media 색이 노랗게 되면 안 되는지를 설명하도록 하겠습니다. 세포를 배양하는 Media에는 pH Indicator로 Phenol red라는 지시약이 첨가되어있습니다. 해당 지시약 때문에 Media의 pH에 따라 Media 색이 변하게됩니다 (그림 1). Media를 갈아주지 않고 세포를 계속 키우다보면 어느 순간 Media 색이 노랗게 변하는데, 이는 Glycolysis로 인해 생기는 부산물 중 하나인 Lactic acid로 인해 Media pH가 감소하기 때문입니다 (그림 2). 그러면 Media 색이 노랗게 되는 것을 통해 우리는 어떤 정보를 얻을 수 있을까요? Media 색을 변화시킬 만큼 세포로부터 산성의 부산물이 나왔다는 것은 달리 말하면 그만큼 많은 양의 세포호흡이 일어났는 말이며, 이는 결과적으로 영양소가 고갈되었다는 것을 의미합니다. 따라서 노랗게 색이 변한 Media에는 세포가 필요로하는 영양소 거의 고갈되었다고 이해하면 쉽습니다. 그러면 영양소가 고갈되면 세포는 어떻게 반응할까요? 다양한 반응들이 있겠지만, 영양분이 부족하면 단백질 합성이 중단됩니다. 세포는 다양한 에너지를 필요로 하는데, 단백질을 합성하는데 있어서는 단백질을 구성하는 아미노산이 필수적으로 필요합니다. 아미노산이 결핍되면 결과적으로 아미노산 센서인 Gcn2가 활성화되고, 활성화된 Gcn2는 Translation initiation factor인 eIF2α를 비활성화(인산화)시킴으로써 단백질합성 자체가 중단되도록 합니다 (Donnelly et al., 2013). 이러한 세포 내 신호전달을 알지 못하더라도 아미노산이 결핍되면 당연히 단백질을 만들기 어렵게 됩니다. 또한 Glucose가 결핍되어도 다양한 경로를 통해 단백질 합성이 중단되게 됩니다(Zhang et al., 2020). Flow cytometry를 이용해서 단백질을 측정하려고 하는데 단백질 합성이 중단된 상태의 세포를 가지고 실험을 한다면 제대로 된 실험 결과를 얻는 것이 당연히 불가능합니다. 면역학 연구에서는 면역세포를 특정 Subset으로 분화시키고자 며칠동안 in vitro culture 하기도 하고, 조직에서 얻어낸 면역세포의 Cytokine 발현 양상을 보고자 PMA/Ionomycin (P/I) 처리하에 4-5시간 정도의 짧은 시간동안 ex vivo culture 하기도 합니다. 그런데 Media가 감당할 수 있는 능력을 초과하는 양의 세포를 키우게 되면 결국 Media 색이 노랗게 변합니다. 또한 이런 한계는 Cell type/subset에 특이적입니다. 따라서 연구자 본인이 연구하는 세포 타입에 맞게 적절한 세포 수를 결정해야 합니다. 저의 경우 EAE라는 자가면역질환 모델을 연구하는데, 질병이 유도된 마우스의 Spinal cord에서 얻은 세포에는 Th17 cell이라는 세포가 많이 들어있고, 이 세포들은 다른 세포들과 비교할 때 Glucose 의존도가 매우 높습니다. 그래서 다른 세포들의 경우 96-well plate에 1 X 106 cells를 넣어도 괜찮지만, 해당 세포는 1 X 106 cells를 넣고 4 시간동안만 P/I 처리해도 그 사이에 Media가 노랗게 변할 때가 있습니다. 이런 경우에 해당 세포를 Flow cytometry로 분석해보면 Cytokine 합성이 제대로 이루어지지 않은 것을 확인 할 수 있습니다 (그림 3). 만약 실험을 했는데 Media 색이 노랗게 된다면 세포 수를 줄여서 해당 실험은 다시 하는 것을 추천드립니다. 이런 경우에는 앞서 설명한 이유로 인해 단백질 합성이 제대로 일어나지 않고 (영양분의 결핍으로 인한 세포 호흡의 변화는 면역세포 분화에도 영향을 줍니다.), 결국 제대로 된 결과를 얻을 수 없게 됩니다. 따라서 Media 색이 노랗게 되었다면 가능하면 재실험을 추천드립니다. 만약 궁금해서 분석을 해보고싶다면 반드시 연구노트에 Media 색이 노랗게 되었다는 걸 기록해두시고 (사진을 찍어두는 것도 교수님과 Discussion 할 때 도움이 됩니다.) 앞서 설명한 원리에 근거하여 해당 데이터는 이후에 통계처리에서 제외하시기를 추천드립니다.   2. FSC와 SSC의 중요성 Flow cytometry로 분석을 할 때는 가장 먼저 FSC와 SSC를 이용하여 세포들을 Gating을 하게 됩니다. FSC(Forward scatter)는 세포의 크기를 알려주는 지표이며, SSC(Side scatter)는 세포의 Granularity를 알려주는 지표입니다. 물론 이 정보를 가지고 어느정도 Lymphocyte, Monocyte, Granulocyte 등등을 크게 구분지을 수 있지만, 단순히 이렇게만 말해서는 크게 도움이 되지 않습니다. 이번 글에서 FSC와 SSC를 통해 강조하고 싶은 것은 1) 죽은 세포 및 불순물(Debris)을 걸러내는 것과 2) 단세포(Singlet)만을 Gating하는 것입니다.   1) 죽은세포 및 불순물 거르기 죽은 세포를 제대로 골라내기 위해서는 뒤에서 설명할 Viability dye를 이용해야하지만, FSC/SSC plot에서 일차적으로 골라내주는 작업이 매우 중요합니다. FSC값이 지나치게 작은 세포들은 죽은 세포들이거나 불순물인 경우에 해당합니다 (그림 4). 따라서 이런 세포들은 분석에서 제거해야합니다.   2) 뭉쳐있는 세포 거르기 (Doublet discrimination) Flow cytometry의 핵심 기술 중 하나는 세포를 한 번에 하나씩 흘려보내서 하나씩 분석하는 것입니다. 하지만 이런 기술에도 한계는 존재합니다. 어쩌다보면 세포들이 서로 엉겨붙는 등의 이유로 두 개 이상의 세포가 마치 하나의 세포인 것처럼 분석될 수도 있습니다. 이런 경우 본래 발현해야하는 단백질이 아닌 단백질이 발현되는 것처럼 분석될 수도 있고, 단백질이 실제보다 더 많이 발현되는 것처럼 분석될 수도 있습니다. 따라서 이러한 오류를 제거하기 위해서 단세포(Single cell, 기계가 읽는 신호 관점에서는 Singlet)만을 분석하는 것이 매우 중요하며, Singlet을 Gating하는데는 FSC-H와 FSC-A를 이용합니다. 물론 다른 Parameter를 활용할 수도 있지만, FSC-H vs FSC-A 전략을 소개하도록 하겠습니다. FSC가 만드는 전기적 신호는 구체적으로 FSC-H(Height), FSC-W(Width), FSC-A(Area)로 구분됩니다. 쉽게 말해서 각각은 세포에 의해 발생하는 신호(Pulse)의 높이, 너비, 면적을 의미한다고 이해하면 쉽습니다. 이론적으로 세포는 구형이기 때문에 하나의 세포가 지나갈 때 갖는 FSC-H와 FSC-A의 값은 비례해서 증가합니다. 하지만 세포가 두 개 이상 붙어서 분석될 경우에는 FSC-H 값에 비해 FSC-A의 값이 더 큰 비율로 증가하게 됩니다 (그림 5). 따라서 이렇게 FSC-A의 값이 FSC-H값에 비해 지나치게 큰 세포들은 제거하고 Singlet만을 분석해야 올바른 분석을 할 수 있습니다.   3. Viability dye의 필요성 앞서 FSC/SSC를 이용해 죽은 세포들을 구분해낸다고 했지만, 이 방법으로 죽은 세포들을 다 골라내는 것은 불가능합니다. 일반적으로 생각할 때, Apoptosis가 일어나는 세포를 골라낸다고 생각하면 Annexin V를 떠올립니다. Annexin V는 세포막의 인지질(Phospholipid)중에서 Phosphatidylserine (PS)과 결합하는 물질로서, 세포에서 Apoptosis가 일어날 때 세포막 바깥쪽으로 PS가 재배치되는 원리를 이용해서 Apoptosis가 진행중인 세포를 골라낼 수 있습니다. 따라서 형광 표지된 Annexin V는 PS에 결합되어 Apoptosis 초기의 세포부터 이미 세포막이 망가진 세포까지 모두를 골라낼 수 있지만, 칼슘이 있는 별도의 Buffer를 지속적으로 사용해야한다는 부분에서 매번 Annexin V를 이용해 Flow cytometry sample을 준비하기에는 현실적인 어려움이 있습니다. 이런 이유로 Annexin V와는 조금 다른 원리로 작용하는 Viability dye를 더 많이 사용하고 있습니다. 회사마다 제품명은 다르지만, 지금 설명하고자하는 Viability dye는 단백질에 비특이적으로 결합하는 Fluorescent dye입니다. 그런데 이 Dye는 세포막을 투과하지 못하기 때문에 살아있는 세포의 경우 세포막 바깥 부분만 염색이 됩니다. 반면 이미 세포막의 내구성이 망가진 세포들의 경우, Dye가 세포 내부로 침투하여 세포 내부의 단백질을 염색시키므로 훨씬 더 높은 형광신호를 만들어냅니다 (그림 6). 그림 6에서 보듯이 (물론 일부러 죽은 세포들이 많은 극단적인 예를 가져오긴 했지만) FSC와 SSC로 구분되지 않는 죽은 세포들이 상당히 많은 것을 확인할 수 있습니다. 따라서 Viability dye를 이용하지 않고 분석을 하면 이미 죽은 세포들을 포함한 분석을 하게 되는 것입니다. 상대적으로 저가의 Flow cytometer의 경우 다양한 형광을 측정하는데 한계가 있어서 Viability dye를 추가하기에는 Panel이 모자를 수가 있습니다. 하지만 다양한 형광을 측정할 수 있는 기계라면 반드시 별도의 형광 Viability dye를 이용해서 죽은 세포들을 제외시키고 분석하시기를 추천드립니다. 주로 사용하는 형광항체들과의 호환성을 높이기 위해서 사용빈도가 낮은 형광 Panel을 Viability dye로 이용하면 좋습니다. 이런 이유로 제가 있는 실험실에서는 405 nm/506 nm의 Excitation/Emission spectrum을 갖는 Dye(Viability dye eFluor 506)를 주로 이용하고 있습니다.   4. Spillover와 compensation에 대한 바른 이해 이전에 올렸던 Flow cytometry를 소개하는 글에서 형광의 원리에 대해 간략하게 설명했습니다. 형광 Dye가 단파장의 빛에 의해 활성화되고, 그 결과로 단파장의 빛을 내보낸다면 매우 이상적일테지만, 실제로는 꽤 넓은 스펙트럼의 빛에 의해 활성화될 수 있고, 이에 대한 반응으로 스펙트럼을 갖는 빛을 만들어냅니다. 이러한 이유로 Spillover라는 현상이 발생합니다 (그림 7). 간단하게 말하자면 FITC라는 형광물질과 PE라는 형광물질로 동시에 세포를 염색하면 두 형광물질에서 발생한 신호가 서로를 침범하여 분석에 오류를 만드는 것입니다. 따라서 기계가 인식한 빛이 FITC로 부터 온 것인지 PE로부터 온 것인지를 제대로 알 수 있도록 보정하는 과정이 필요하고, 이런 과정을 Compensation이라고 부릅니다. 이에 대한 구체적인 내용들을 이 글에서 자세히 설명하기에는 그 내용이 너무 많아서 해당 내용들을 전부 다룰 수는 없지만, Compensation은 올바른 Flow cytometry 분석을 위해 필수적으로 선행되어야하는 매우 중요한 과정입니다. 따라서 이부분을 잘 모르시면 반드시 개별적으로 찾아보셔서 Compensation을 제대로익히시기를 바랍니다. 이 글에서는 조금 극단적인 예시를 통해 Compensation이 잘못될 경우 분석이 어떻게 달라질 수 있는지를 보여드리고자합니다. 그림 8은 동일한 샘플이 Compensation이 잘못됨으로 인해 다르게 분석될 수 있음을 보여주는 예시입니다. 단백질A가 높게 발현될 수록 단백질B의 발현도 높게 발현된다는 내용이지만, Compensation이 안 되어 단백질A의 형광이 단백질B의 형광으로 Spillover가 일어날 경우 그 내용이 과장될 수 있고, 반대로 Compensation이 너무 되어서 단백질A의 형광신호가 감소하면 단백질A와 단백질B의 상관관계가 사라지게 될 수도 있습니다 (그림 8). 많은 경우에 조심해야하는 부분은 Compensation이 덜 되어서 본래는 없는 상관관계가 마치 양적 상관관계 (Positive correlation)에 있는 것처럼 잘못 분석되는 경우입니다. 분석하고자하는 마커(예시에서는 단백질B)가 예시의 경우처럼 Negative population과 Positive population이 명확히 구분되지 않는 경우에는 특별히 주의를 기울여야 합니다. 올바른 Compensation을 위해서 지켜야하는 규칙들 중에서 개인적으로 가장 중요하다고 여겨지는 세 가지만을 소개하겠습니다. 1) Compensation control로 사용하는 형광은 실제 샘플이 내는 형광보다 밝아야 합니다. 2) 가능하다면 실제로 사용한 형광을 Compensation control로 사용해야합니다. 예를 들어 FITC와 Alexa Fluor 488은 매우 유사한 Excitation/Emission spectrum을 갖지만 결코 같은 형광물질이 아닙니다. 따라서 실제 샘플에 사용된 형광물질이 FITC라면 FITC를 이용해 Compensation하는 것이 정확합니다. 비슷한 예로 APC와 eFluor660, Alexa Fluor 647 들은 비슷하지만 분명히 서로 다른 형광물질들입니다. GFP같은 형광단백질이 사용되었다면 해당 형광단백질을 많이 발현하는 세포를 Compensation control로 사용하는 것이 좋습니다. 3) Tandem Dye (PE-Cy7, PE-eFluor 610, PerCP-Cy5.5, APC-Cy7 등과 같이 두 개의 형광물질이 붙어서 Donor에서 나오는 Emission이 Receptor의 Excitation으로 작용, FRET 원리를 응용한 Dye)를 사용할 경우에는 반드시 샘플을 염색할 때 사용한 형광항체와 동일한 Batch를 사용해야합니다. 항체 Batch마다 Tandem Dye의 결합비율 및 정도등이 차이가 생기기 때문입니다. 쉽게 말해서 같은 형광 적힌 다른 항체 사용하지 말고 사용한 항체 바로 그 Vial을 사용해야 한다는 말입니다. 아주 중요한 부분입니다.   5. Fixation/Permeabilization 방법 변화 저는 Flow cytometry를 이용해서 샘플을 분석할 때 대부분의 경우에 Intracellular cytokine을 분석합니다. 이러한 이유로 거의 늘 Fixation/Permeabilization과정을 거치게 되는데 어떤 Cytokine의 경우 Fixation/Permeabilization 방법을 달리 했을 때 분석이 더 잘 되는 경우가 있습니다. 대부분의 경우에 eBioscience에서 만드는 Fix/Perm Kit를 사용하는데, 어찌된 이유에서인지 이 Kit를 사용해서 in vitro에서 키운 CD4 T cell의 GM-CSF발현을 체크하면 GM-CSF발현이 제대로 확인되지 않습니다. 그런데 어찌된 이유에서인지 회사제품이 아니라 실험실에서 직접 제조한 2% PFA와 Saponin solution (0.05%)을 이용하면 GM-CSF 발현이 잘 측정됩니다 (그림 9). 그 명확한 이유는 잘 모르겠습니다만, 이처럼 Fixation/Permeabilization 방법에 따라 측정되는 정도가 변하는 단백질들이 있습니다. IL-4의 경우도 PFA/Sapoin을 이용하면 조금 더 잘 측정이 됩니다. 연구자들마다 연구하는 단백질들이 다를텐데 혹시 본인이 연구하는 단백질이 분명히 존재함에도 불구하고 Flow cytometry로 측정이 잘 안 될 경우 Fixation/Permeabilization 시약이나 반응 조건(예를 들어 온도)을 바꿔보는 것을 추천합니다. 물론 항상 이 방법으로 문제가 해결되지는 않습니다.   6. 형광 Dye의 명칭 이해 형광항체에 붙은 형광물질들은 그 종류가 매우 다양합니다. 또한 제조사마다 이름을 붙이는 방식도 달라서 Flow cytometry를 처음 접하는 연구자들에게는 어떤 형광은 같이 써도 되고 어떤 형광은 같이 써서는 안 되는지 무척이나 헷갈립니다. 따라서 간단하게 몇가지 형광 Dye들을 소개하고자합니다. 기본적으로 4-color flow cytometer에서 지원하는 Panel의 대표격인 FITC(Fluorescein isothiocyanate), PE(Phycoerythrin), APC(Allophycocyanin)정도는 알 것입니다. 이중에서 PE와 APC는 자연에서 유래한 단백질들이며, 다른 형광물질들에 비해 상대적으로 크기도 큽니다.   1) Alexa Fluor 시리즈 Alexa Fluor(AF)로 시작하는 형광물질들을 들어보셨을 겁니다. 대표적으로 FITC와 비슷한 스펙트럼을 갖는 AF 488이 있습니다. AF 뒤에 나오는 숫자는 해당 형광 Dye의 최적 Excitation 파장에 해당하는 숫자입니다. Alexa Fluor dye들의 경우 상대적으로 다른 형광물질들에 비해 안정적이라고 알려져있습니다. 이러 이유로 샘플을 슬라이드에 오래 보관하면서 여러 번 현미경으로 찍어야하는 Immunohistochemistry에 Alexa Fluor dye를 많이 사용됩니다. Flow cytometry에서 많이 사용되는 것은 AF 488 (FITC 대체), AF 647(APC 대체), AF 700 정도가 있습니다.   2) eFluor 시리즈 eFluor는 eBioscience에서 자체적으로 개발한 형광 Dye에 붙는 이름입니다. Alexa Flour와는 반대로 해당 Dye가 내는 최적의 Emission 파장에 해당하는 숫자가 eFluor 뒤에 붙습니다. eBioscience에서는 Flow cytometry를 위한 다양한 형광항체들을 개발하기 때문에 Flow cytometry에 사용될 수 있는 eFluor 시리즈도 많이 있습니다. 주로 eFluor 450 (Pacific Blue 대체), eFluor 506 (AmCyan 대체), PE-eFluor 610 (PE-Texas Red 대체), PerCP-eFluor 710 (PerCP-Cy5.5), eFluor 660 (APC 대체), APC-eFluor 780 (APC-Cy7 대체) 등이 사용됩니다.   BD사에서 만든 Fluorochrome chart를 첨부파일로 올려두었습니다. BD에서 만든 내용이다보니 경쟁사 eBioscience에서 만드는 eFluor 시리즈는 나오지 않지만, 어떤 형광을 같이 사용하면 안 되는지, 어떤 형광이 상대적으로 밝은지 등에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 참고하셔서 연구에 도움이 되길 바랍니다.   7. Staining protocol-96-well plate 이 부분은 넣을지 말지 고민을 했었으나, 혹시라도 누군가에게는 도움이 될 수도 있겠다는 생각이 들어서 넣습니다. 똑같은 실험이라고해도 실험실마다 조금씩 방법에 차이가 있습니다. 한국에서 석사를 할 때 Flow cytometry를 위해 세포들을 염색할 때 1.5 ml EP tube를 이용해 하나씩 샘플을 준비했었습니다. 그런데 지금 제가 있는 듀크대학교에서는 96-well plate를 이용하더군요. 샘플의 양이 많은 경우 훨씬 더 빠르게 샘플을 준비할 수 있기 때문에 해당 프로토콜을 소개합니다. 단 Round-bottom (또는 V-bottom) 96-well plate를 사용하셔야합니다.   1. 96-well plate를 준비하고 샘플 순서를 Plate lid에 표기합니다. 또한 샘플이 들어갈 Well 테두리를 마커를 이용해 표시해줍니다. 2. 준비된 세포를 각 Well에 넣어줍니다. 세포의 숫자는 1 X 106개를 넘지 않도록 해주며, Volume은 200 ul정도를 넘지 않도록 해주는 것이 좋습니다. 96-well plate의 경우 Well 한 개에 최대 300 ul까지도 들어가지만 거품이 생기거나 조금만 잘못 다룰경우 샘플간의 교차오염이 생길 수 있기 때문에 최대 Volume은 200-250 ul로 맞추는 것이 좋습니다. 3. 1400 rpm 조건에서 4분간 원심분리합니다. 4. Plate를 개수대로 가져간 뒤 (Plate lid를 열고) Plate를 뒤집으면서 한 번 털어줍니다. 주의 할 것은 재빠르게 ‘한 번’만 털어주는 것입니다. Plate가 뒤집어진채로 Paper towel에 ‘한 번’ 살짝 닦아줍니다 (닦는다기보다는 갖다 댄다는 표현이 더 정확합니다). 털어준 즉시 닦아야하며, 뒤집은 Plate를 Paper towel에 두드리면 안 됩니다. 다시 Plate를 똑바로 뒤집어줍니다. 세포가 마치 없어진 것 같지만 그대로 있으니 믿음을 갖고 진행하시면 됩니다. 5. PBS 또는 FACS buffer로 Wash과정이 필요한 경우 200 ul의 Buffer를 넣어주고 Multi-channel pipette으로 세포를 풀어준 뒤, 3-4과정을 반복합니다.  6. 각 Well에 형광항체가 섞인 Buffer를 100 ul씩 넣어줍니다. 샘플이 많은 경우 Buffer reservoir(ELISA 할 때 사용하는 reservoir)와 Multi-channel pipette을 이용하시면 좋습니다. Reservoir를 사용할 경우 최소 400 ul를 추가로 준비해야합니다. 7. Staining이 끝난 뒤 FACS buffer를 100 ul 넣어준 뒤 3-5과정으로 Wash 해줍니다. 8. 이후 Fixation/Permeabilization과정이 필요한 경우도 같은 원리로 진행합니다.   엄청난 비결이 숨겨진 프로토콜은 아니지만 96-well을 이용해서 빠르고 간편하게 Wash 및 Staining 할 수 있는 프로토콜입니다. 이미 이렇게 하고 계신 연구자분들이 있겠지만, 한국에서 석사할 때 저의 경험으로 볼 때는 그렇지 않은 연구실들도 있기 때문에 해당 프로토콜을 공유하였습니다. 개수대에서 털어낸 이후에 세포가 사라진 것 같지만, 이렇게 해서 세포가 사라진적은 한 번도 없으니 믿음을 가지고 하시면 됩니다. 도움이 되길 바랍니다.   8. Flow cytometry 관련 유용한 소스들 Flow cytometry 관련해서 유용한 소스들의 링크를 첨부하고 간략한 설명을 덧붙였습니다. 연구에 도움이 되길 바랍니다.   1) Bio-Rad Flow Cytometry Basics Guide https://www.bio-rad-antibodies.com/introduction-to-flow-cytometry.html Flow cytometry와 관련된 많은 기초 지식들을 배울 수 있습니다.   2) Spectrum Viewer_BD Bioscience https://www.bdbiosciences.com/en-us/applications/research-applications/multicolor-flow-cytometry/product-selection-tools/spectrum-viewer 다양한 형광물질들의 Excitation/Emission spectrum을 보여줄 뿐 아니라 여러 형광물질들의 스펙트럼을 동시에 보여줌으로써 Spillover가 심한지 양호한지를 어느정도 예상할 수 있는 유용한 도구입니다. 직관적인 구성덕분에 사용하기가 편리합니다. 다만 아쉬운 부분은 경쟁사인 eBioscience에서 만드는 eFluor 시리즈는 정보가 없습니다.   3) Flourescence SpectraViewer_ThermoFisher https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html#!/ eBioscience사를 인수한 ThermoFisher Sicentific사에서 제공하는 스펙트럼뷰어입니다. 개인적으로는 위에 소개한 BD사에서 제공하는 뷰어를 조금 더 선호하지만 eFluor 시리즈의 정보를 확인할 때 유용하게 사용할 수 있습니다.   4) Bio-Rad Spectraviewer https://www.bio-rad-antibodies.com/spectraviewer.html 앞서 소개한 두 개의 스펙트럼뷰어와 유사하지만, 두 회사에서 자체적으로 제작하는 형광들에 대한 정보를 모두 포함한다는 점에서 중립적인 스펙트럼뷰어라고 말하고 싶습니다.     9. 마치는 글 Flow cytometry를 주로 이용해서 실험을 하다보니 그만큼 Flow cytometry에 대해 하고싶은 말이 많은 것 같습니다. 너무 많은 내용을 한 번에 전달하는 것이 오히려 가독성을 해치지는 않을까하는 염려도 있지만, 전해주고싶은 내용이 너무 많아서 글을 준비하다보니 내용이 참 길어졌습니다. 나름 줄이고 줄였는데도 내용이 많은 것을 보면서 투머치토커라는 제 별명이 어느정도 맞다는 생각이 들어 입가에 미소가 지어지네요. 늘 그렇듯이 이 내용들이 누군가에게는 도움이 되길 바라며 글을 마치겠습니다.     References Donnelly, N., Gorman, A.M., Gupta, S., and Samali, A. (2013). The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cell Mol Life Sci 70, 3493-3511. Zhang, C.S., Hardie, D.G., and Lin, S.C. (2020). Glucose Starvation Blocks Translation at Multiple Levels. Cell Metab 31, 217-218. https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/alexa-fluor/alexa-fluor-dyes-across-the-spectrum.html https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/efluor-organic-dyes.html https://www.bdbiosciences.com/documents/Multicolor_Fluorochrome_Guide.pdf          
박은총  |  2020.08.06  |  댓글 5
프로토콜 [연재][후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트] #2_Flow Cytometry_입문
* 본 글은 "BRIC Bio통신원의 연재"에 올려진 동일한 제목의 컨텐츠를 "프로토콜"에서도 소개하기 위해 동일한 내용으로 올렸습니다(클릭시 연재글로 이동).     후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트에서 두 번째로 소개할 내용은 면역학 연구에서 빼놓을 수 없는 실험기법인 Flow cytometry에 대한 내용입니다. Flow cytometry는 면역학에서만 써야 하는 것은 아니지만, 면역학 연구에 필수적인, 어쩌면 기본적인, 실험기법이라고 할 수 있습니다. 다양한 면역세포를 구분하기 위해서 반드시 필요한 기법이 Flow cytometry이기 때문입니다. 이번 글에서는 Flow cytometry의 원리와 실제 연구에서 사용되는 예시들을 구체적으로 소개하도록 하겠습니다. 이 내용들이 면역학 연구를 하고 있는 석박사생들에게 도움이 되기를 바랍니다.       1. 들어가는 글: 세포를 눈으로 보고 싶은 욕망 오래전 과학자들은 눈으로 직접 세포를 관찰하기 위해서 현미경을 만들었고, 세포들의 모양을 보고 세포들을 구분 짓기 시작했습니다. 하지만 다양한 염색기법들의 개발에도 불구하고 눈으로 보는 방법으로 면역세포를 구분 짓는데는 너무나도 큰 한계가 있습니다. 비슷하게 생긴 면역세포들이라고 해도 육안으로 식별할 수 없는 세포막단백질, 싸이토카인(Cytokine), 세포 내부의 전사조절인자(Transcription factor) 등의 차이에 따라 서로 다른 면역세포로 구분되기 때문입니다. 만약 세포 표면에 발현하는 단백질들을 눈으로 볼 수 있고 그 발현정도도 수치화할 수 있다면, 각 단백질의 발현 정도에 따라 세포를 2차원 그래프에 그림. 1과 같이 표현할 수 있을 것입니다 (그림. 1). 그러나 실제로는 눈으로 볼 수 없는 것이 문제가 됩니다. 과학자들은 이러한 문제를 해결하기 위해 형광항체(Fluorochrome-conjugated antibody)를 개발했고, 세포수준에서 각 형광의 세기를 측정할 수 있는 기계를 개발했습니다.     2. Flow cytometry의 기본 원리 1 – 세포 한 개에서의 단백질 발현 정도 측정 Flow cytometry는 한국말로 유세포분석(기법) 또는 유세포분석기(기계)라고 부릅니다. 이름에서 유추할 수 있듯이 이는 두 가지의 핵심 기술이 합쳐진 실험기법입니다. “Flow”라는 부분에서 말하는 기술은 세포를 기계 속으로 한 번에 한 개씩 흘려보내는 기술입니다. “Cytometry”라는 부분은 세포를 분석하는 기술을 의미합니다. 결국 한 번에 한 개의 세포를 흘려보내서 세포 하나씩 분석하는 기술이 Flow cytometry입니다. 이 두가지 기술 중에서 세포를 어떻게 분석하는지에 초점을 맞춰서 설명하고자 합니다. Flow cytometry에서 세포를 분석하는 기술의 핵심은 형광(Fluorescence)입니다. 형광의 개념은 조금 뒤에 설명하기로 하고, 우선 형광은 색이라고 단순하게 가정해보겠습니다. 따라서 형광항체라고 하면, 이는 색으로 구분될 수 있는 항체를 의미하며, 이 항체는 물론 특이적인 항원에 결합하게 됩니다. 연구하고자 하는 면역세포가 CD4와 CD25라는 두 가지 세포막단백질에 의해 구분이 되고, 내가 관심있는 세포는 CD4+ CD25- 세포 (CD4를 발현하고 CD25를 발현하지 않는 세포) 라고 가정해보겠습니다. 특정 샘플 안에 내가 원하는 CD4+ CD25- 세포가 얼마나 있는지를 알고 싶다면, 샘플을 구성하는 전체 세포의 CD4와 CD25 단백질 발현양상을 우선적으로 측정하고, 그중에서 내가 원하는 세포가 몇 개인지 개수를 세면 됩니다. 따라서 그림. 2와 같이 CD4와 CD25에 각각 결합하는 형광항체로 염색된 세포를 준비하면, 기계는 각 세포에 CD4와 CD25가 얼마나 발현되어 있는지를 각각의 항체 색깔을 읽어냄으로써 분석하게 됩니다 (그림. 2). 그림. 2에서의 경우를 본다면 전체 세포 7개 중에서 CD4+ CD25- 세포는 2개이므로, 내가 연구하는 세포는 해당 샘플에서 28.6% 만큼 존재함을 확인할 수 있습니다. 물론 분석하는 세포 개수를 증가시킬 수록 분석의 정확도는 올라갑니다. 이처럼 세포 하나 하나에 특정 단백질(세포막단백질, 싸이토카인, 전자조절인자 등등)이 얼마나 존재하는지를 분석하는 것이 Flow cytometry 기법입니다. Western Blot이 샘플 전체에서 특정 단백질의 양을 비교하는 것이라면, Flow cytometry는 세포 한 개 수준에서의 단백질 양을 비교하는 것이라고 할 수 있습니다.   3. Flow cytometry의 기본 원리 2 – 형광(Fluorescence)에 대한 이해 학부생 때 수업을 통해 형광의 개념에 대해 배웠던 기억이 납니다. 그런데 당시에는 이론으로만 배우니 감이 잘 오지 않았고, 이후에 직접 형광항체를 가지고 실험을 해보면서 형광에 대해 이해하게 된 경험이 있습니다. 그만큼 어찌 보면 단순히 이론으로만 설명하기엔 어려울 수 있는 개념이 형광이라고 생각됩니다. 실제로 다양한 형광항체를 사용해보면서 어떤 형광물질들이 존재하고, 각 형광물질들은 어떤 특징을 갖는지 익히는 것이 형광에 대한 이해를 높이는 가장 효과적인 방법이라는 생각이 듭니다. 그럼에도 불구하고 이해하기 쉽도록 설명해보겠습니다. Flow cytometry의 핵심은 결국 항체에 연결된 형광이라고 하는 색을 분별하는 것입니다. 마치 눈으로 다양한 색을 구분해 낼 수 있듯이, Flow cytometry도 다양한 형광이라는 색을 구분해냅니다. 우리가 눈으로 사물의 색을 인식할 때는 광원이라고 하는 외부에서 주어지는 빛이 필요합니다. 예를 들어 태양에서 나오는 가시광선이 사물에 닿고, 사물이 흡수하지 않고 반사하는 특정 파장의 빛을 눈에서 색으로 인식하는 것이죠. 이와 같이 일상생활에서 우리가 눈으로 인식하는 색은 사물이 흡수하지 않고 튕겨내는 빛의 파장입니다. 이러한 이유로 암실에서 붉은 불이 켜졌을 때는 사물에서 반사되는 빛의 종류가 붉은색뿐이므로 모든 사물들이 붉게 보이는 것이죠. 하지만 형광은 조금 다릅니다. 형광물질이라고 말할 수 있는 특정 물질에 “특정 파장”의 빛(에너지)이 주어지면, 형광물질은 자신에게 해당하는 “고유한 파장”의 빛(에너지)을 내보내게 됩니다. 앞서 예를 든 눈으로 사물의 색을 인식하는 경우에서는 사물에 반사되는 빛을 인식하는 것이라서 광원 종류에 따라 사물의 색이 다른 색으로 인식이 되기도 하지만, 형광은 특정 에너지(특정 파장)가 주어졌을 때 형광물질이 스스로 만들어내는 “고유의 색(에너지)”이기 때문에 하나의 형광물질은 늘 “같은 파장”의 빛을 만들어냅니다. (여기서 말한 빛들은 사실 단파장의 빛은 아니고 어느 정도의 스펙트럼을 가지기 때문에 엄격하게 말하자면 제 설명이 틀린 것이지만, 이해를 돕기 위해 이와 같이 설명하였습니다.) 요약하자면 형광물질은 1) 빛을 내기 위해 제공 되어야 하는 에너지(특정 파장의 빛, Excitation spectrum)를 필요로 하며, 2) 그 결과 특정 파장의 빛(Emission spectrum)을 내보냅니다. 이러한 형광의 특징을 활용해 특정 파장의 빛(Laser)을 조사했을 때 해당 형광물질이 발색을 하는지를 (자신만의 고유 파장의 빛을 내보내는지를) 기계가 측정하고, 그 세기를 측정함으로써 특정 형광항체의 존재 및 양 (=항원의 존재 및 양)을 측정하는 것이 Flow cytometry입니다.   4. Flow cytometry의 기본 원리 3 – 형광(Fluorescence)의 필수요소 두 가지: Excitation vs Emission spectrum 앞서 살펴본 대로 형광이 빛을 내기 위해서는 적절한 Input이 필요하고, 적절한 Input이 들어오는 경우에 늘 정해진 Output을 냅니다. 그런데 Input과 Output에 해당하는 빛들은 사실 단파장의 빛이 아니고 아니고 특정 스펙트럼의 빛입니다. FITC라고 불리는 형광물질을 예를 들어 설명해보겠습니다. FITC가 활성화돼서 내는 빛은 스펙트럼을 갖지만, 그중에서 약 520 nm 근처 파장의 빛이 가장 세게 측정된다는 것을 그림. 3의 그래프에서 확인할 수 있습니다. 물론 다른 파장의 빛도 검출이 되지만, 520 nm 근처 파장의 빛의 세기가 가장 강하기 때문에, Flow cytometry는 515 nm – 545 nm 파장의 빛을 인식할 때 이를 FITC로 인식합니다. 이처럼 FITC가 방출해내는 빛의 세기를 파장에 따라 그래프로 표현한 것이 FITC의 Emission spectrum 입니다. 그런데 FITC가 가장 효율적으로 강한 형광을 만들기 위해서는 가장 효율적인 Input이 필요합니다. FITC에 가해지는 빛의 파장에 따라 FITC가 만들어내는 빛의 세기는 달라지며, 주어진 빛의 파장에 따라 FITC가 만드는 형광의 세기를 표현한 것이 Excitation spectrum 입니다. 그림. 3의 Excitation spectrum에 다르면 FITC는 495 nm 근처 파장의 빛을 받을 때 가장 밝은 빛을 내지만, 다른 파장의 빛을 받을 때는 만들어내는 형광의 세기가 감소합니다. 예를 들어 430 nm 근처 파장의 빛을 받을 경우 FITC가 만들어내는 형광의 세기가 90% 이상 감소하게 됩니다. 이러한 형광의 특징 때문에 Flow cytometry는 488 nm 파장의 빛을 조사하여 이에 대한 Output으로 515 nm – 545 nm 파장의 빛을 인식할 경우 이를 FITC로 해석하게 됩니다. 각기 다른 여러 파장의 빛을 조사한 뒤 수집되는 빛의 파장을 분석하여 검출된 파장의 빛을 분석하는 것이 Flow cytometry가 색을 인식하는 방법이며, 이러한 원리로 매우 다양한 종류의 형광항체를 구분해낼 수 있습니다 (표. 1).   5. Flow cytometry를 이용한 실험의 예 Flow cytometry를 이용해 할 수 있는 실험은 매우 다양합니다. 그중 몇 가지 대표적인 활용 예들을 소개해보도록 하겠습니다. 1) 형광항체를 활용한 실험 Flow cytometry를 소개하면서 이미 어느 정도 다룬 내용이지만, Flow cytometry의 가장 주된 목적은 세포가 발현하는 여러 가지 단백질들을 분석함으로써 해당 세포가 어떤 세포인지를 알아내고 분석하는 것입니다. 따라서 여러 가지 단백질(항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 형광항체들이 이미 많이 개발되어 있고, 이러한 형광항체들을 활용해 세포들이 어떤 단백질들을 발현하고 있는지를 분석할 수 있습니다. 이러한 다양한 단백질 발현 프로필은 면역세포의 종류를 구분할 수 있는 방법입니다 (그림 4). 비록 앞에서는 세포 표면에 존재하는 막단백질만을 예로 들었으나, 세포 내부에 존재하는 전사조절인자 (그림. 4B) 및 싸이토카인 (그림. 4C) 도 형광항체로 염색하여 측정할 수 있습니다. 싸이토카인 같은 경우 세포가 분비해내는 단백질이지만, 단백질 수송 억제제 (Protein transport inhibitor)를 이용해 세포 내부에(Golgi 및 ER) 싸이토카인이 축적되도록 하여 측정할 수 있습니다. 형광항체를 사용하는 것은 단순히 단백질의 유무를 확인하는 것에 제한되지 않습니다. 흥미롭게도 인산기가 붙은 단백질(Phosphorylated protein)의 양을 확인하는 것도 가능합니다. 예를 들어 CD4+ T cell이 활성화되면 MAPK signal이 활성화되면서 ERK 단백질이 인산화됩니다. Fluorochrome-conjugated anti-phospho-ERK antibody를 활용하면 CD4+ T cell의 세포 수준에서 인산화된 ERK의 양을 측정할 수 있습니다 (그림. 5). 물론 Flow cytometry를 목적으로 개발된 형광항체의 종류가 Western blot을 목적으로 개발된 항체의 종류보다는 적기 때문에 인산화 정도를 Flow cytometry로 분석하는 데는 여전히 어느 정도 한계가 있지만, 세포 수준에서 분석한다는 부분에서 큰 장점이 있습니다. Flow cytometry를 위한 형광항체는 eBioscience, BD Bioscience, Biolegend 등등의 회사에서 개발되고 있으며, 원리는 비슷하지만 모든 형광항체가 Flow cytometry와 Confocal microscopy 간에 호환이 가능한 것은 아닙니다. 어떤 형광항체는 Flow cytometry에서는 사용 가능하지만, 신호가 약하거나 불안정해서 형광현미경에는 적합하지 않을 수 있습니다.   2) 형광 단백질 분석 GFP(Green fluorescence protein)와 같은 형광 단백질은 많이 들어봤을 것입니다. 유전자 조작을 통해 세포 내에 이와 같은 형광 단백질이 발현되도록 한 마우스들이 많이 있는데, 세포 내에 발현되는 형광 단백질도 Flow cytometry를 통해 측정이 가능합니다. 이러한 형광 단백질과 Flow cytometry를 활용하면 특정 면역세포가 이전에 어떤 세포였는지를 확인함으로써 세포의 가소성(Plasticity)를 연구하는 것이 가능합니다. 예를 들어 Il17aCre Rosa26YFP 마우스의 경우 IL-17A라는 싸이토카인을 발현했던 경험이 있는 세포에서 지속적으로 YFP가 발현됩니다. 주목해야 하는 것은 일단 IL-17A가 한 번이라도 발현되면 지속적으로 YFP가 발현되기 때문에 현재 IL-17A 발현여부와 상관없이 IL-17A 발현 경험이 있는 세포는 YFP로 표지 된다는 것입니다. 이러한 마우스의 개발 및 Flow cytometry의 활용은 강직성척추염(Multiple sclerosis)의 동물모델인 EAE에서 IFN-γ를 발현하는 CD4+ T cell의 대부분이 IL-17A를 발현하는(혹은 했던) Th17 cell로부터 유래하였음으로 증명함으로써 Th17 cell plasticity에 대한 이해를 넓히는 데 기여했습니다(Hirota et al., 2011) (그림. 6).   3) 형광 Dye를 활용한 실험: Cell proliferation Flow cytometry의 기본이 형광을 측정하는 것이지만, 형광물질이 반드시 항체에만 붙어서 사용되는 것만은 아닙니다. 항체는 아니지만 널리 사용되는 것 중 하나가 CFSE입니다. CFSE는 세포막을 투과하여 세포 내부에 있는 단백질들에 비특이적으로 결합할 수 있는 꽤나 안정적인 형광물질입니다(Parish, 1999). 따라서 세포를 CFSE로 염색하면 염색된 모든 세포는 골고루 CSFE로 염색되고, CFSE는 계속해서 세포 내부에 남아있습니다. 그리고 세포가 분열할 때마다 세포질이 둘로 나뉘면서 각 세포가 보유하는 CFSE의 양도 절반으로 줄게 되고, 이는 결국 한 개의 세포가 낼 수 있는 형광이 절반으로 감소하는 결과를 낳습니다. 이렇게 세포가 n 번 분열함에 따라 이론적으로 CFSE의 형광도 1/2n로 감소하게 됩니다 (그림. 7). 이렇게 CFSE로 염색된 세포가 분열하고, 이를 Flow cytometry로 분석하면 CFSE 형광 수준에 따라 세포들이 구분되고, 각 그룹별 세포들을 비교함으로써 세포분열이 어느정도 일어났는지를 분석할 수 있습니다. 현재는 CFSE와 같은 원리이지만 다른 형광을 띠는 형광 Dye들이 다양하게 활용되고 있습니다.   4) RNA 측정: FISH의 응용 앞서 살펴본 내용들은 단백질을 특이적 또는 비특이적으로 형광염색하여 Flow cytometry로 분석하는 기법들입니다. 그런데 놀랍게도 Flow cytometry를 활용해 RNA도 측정할 수 있습니다. 이는 FISH(Fluorescent in situ hybridization)를 응용한 기법이며, 저도 아직 실제로는 해보지는 않았기 때문에, 이 부분은 Invitrogen에서 개발한 Primeflow RNA Assay 제품을 참고해 설명드립니다. 해당 기술의 핵심은 측정하고자 하는 RNA를 인식할 수 있는 Probe를 제작하여 RNA와 결합시키고, 해당 Probe가 만들어낼 수 있는 형광 신호를 증폭하는 데 있습니다. RNA를 인식하는 Probe를 형광으로 표지할 경우 하나의 Probe가 만들어낼 수 있는 형광의 세기가 너무나도 약하기 때문에 이 신호를 증폭하는 과정이 필요합니다. 따라서 Probe를 인식하는 DNA 서열들(Amplifier)을 추가적으로 덧붙여주고, 형광을 띠는 Labeling probe를 나중에 붙여줌으로써 형광 신호를 증폭시키는 것입니다 (그림. 8). 마치 1차 항체에 2차 항체를 붙여서 신호를 증폭시키는 것과 비슷한 원리입니다. 이러한 간단한 원리에도 불구하고 제품 가격이 상당히 비싸서 접근성이 조금 떨어지는 기술이지만, 세포 수준에서 단백질과 RNA 발현 정도를 비교할 수 있다는 점에서 획기적인 실험기법입니다.   5) 세포 내 칼슘 농도 변화 측정 앞서 Flow cytometry를 이용해서 단백질과 RNA를 측정하는 방법들을 소개했습니다. 그런데 Flow cytometry의 활용 범위는 단백질과 RNA 측정을 뛰어넘어 세포 내 금속이온의 농도 변화를 측정하는 것까지도 확장됩니다. 많은 예들이 있지만, 세포 내 칼슘 농도 변화를 측정하는 것이 대표적인 예라고 할 수 있습니다. 면역 세포가 활성화되면 가장 빠르게 나타나는 현상 중 하나가 세포 내 칼슘이온의 증가입니다. 이렇게 증가한 칼슘이온에 결합하여 형광특성이 변하는 Fluo-4, Fluo-5, Indo-1 등등의 Calcium indicator들이 있고, 이러한 Calcium indicator들은 쉽게 세포 내부로 침투되는 성질들을 갖습니다. 따라서 Calcium indicator를 세포 내부로 투과시킨 후 세포에 적절한 반응을 주어 칼슘농도 변화를 유도하면, 칼슘과 결합한 Calcium indicator에 의한 형광을 실시간으로 측정할 수 있습니다 (그림. 9). 이뿐만이 아닙니다. 칼슘이 결합하는 단백질인 Calmodulin과 M13 domain을 형광단백질에 융합하여 별도의 염색과정 없이 세포 내 칼슘 변화를 측정할 수도 있습니다 (GECI: Genetically encoded calcium indicators). 칼슘이 Calmodulin과 M13 domain에 결합함으로 인해 생기는 단백질 구조 변화가 형광단백질의 형광특성을 바꾸는 것이 그 원리입니다(Zhong and Schleifenbaum, 2019). 해당 단백질이 체내에서 발현되도록 만든 마우스에서를 이용하면 in vivo에서 일어나는 면역세포들의 활성을 실시간으로 측정할 수도 있습니다. 칼슘을 예를 들어 설명했지만, 이 외에도 나트륨, 아연 등의 금속이온 농도 변화, 세포 내 pH 변화, ROS 농도 변화 등을 인식할 수 있는 다양한 형광 Probe가 존재하며, Flow cytometry를 활용해 이러한 세포내 변화를 측정할 수 있습니다.   6) FACS (Fluorescence-activated cell sorting) 마지막으로 소개할 FACS라는 기법은 Flow cytometry를 활용한 기술의 최정점이라고 부르고 싶은 기술로서 Flow cytometry로 분석된 세포들 중에서 특정 세포만을 분류해내는 Sorting 기법입니다. 많은 사람들이 Flow cytometry와 FACS를 같은 의미로 말하곤 하는데, 사실 둘은 서로 다릅니다. Flow cytometry를 활용해 세포를 분류하는 기술이 FACS입니다. 일반적인 Flow cytometry 기계에 추가적으로 설치된 장치가 원하는 세포가 포함된 물방울에 양성 또는 음성 전하(Electronic charge)를 부여하고, 전하를 띠는 해당 물방울을 끌어당겨 해당 세포를 분류해내는 기술이 FACS입니다. 이렇게 분류해 낸 세포는 살아있는 세포들이기 때문에 추가적으로 Culture가 가능합니다. 또한 이렇게 얻은 세포들만을 가지고 Bulk RNA-seq 또는 Single cell RNA-seq 분석을 하는데 사용하기도 합니다. 장비가 매우 고가라서 보통은 Sorting을 전담으로 하는 Technician들이 있고, 연구자들은 Technician에게 부탁하여 원하는 세포만을 분류합니다.   6. 마치는 글 Flow cytometry는 매우 활용도가 높은 기법일 뿐 아니라 면역학 연구에서 기본적으로 사용되는 기법입니다. 제가 현재 연구하고 있는 건물에만 해도 연구자들이 예약해서 쓰는 Flow cytometry 기계가 세 대가 있는데, 늘 예약이 꽉 차서 미리 예약해두지 않으면 쓰기가 어렵습니다. 그만큼 면역학을 연구하는 사람들에겐 꼭 필요한 실험이 Flow cytometry입니다. 사실 Flow cytometry에 대해서는 할 말이 참 많습니다. 다음 글에서는 Flow cytometry를 이용한 실험에서 주의해야 할 부분들에 대해서 다루고자 합니다. 이번 글에서 다 다루자니 내용이 너무 많아 글을 둘로 나눠야하겠다는 필요성을 느끼게 되었습니다. 본래 기획 의도에 맞게 해당 글이 면역학 연구를 시작한 석박사생들에게 도움이 되었기를 바라며 글을 마치겠습니다.   * 본 글에 사용된 데이터 이미지들은 별도의 표기가 없는한 연재자 본인이 얻은 연구 데이터들을 기반으로 제작되었습니다.   References Hirota, K., Duarte, J.H., Veldhoen, M., Hornsby, E., Li, Y., Cua, D.J., Ahlfors, H., Wilhelm, C., Tolaini, M., Menzel, U., et al. (2011). Fate mapping of IL-17-producing T cells in inflammatory responses. Nat Immunol 12, 255-263. Parish, C.R. (1999). Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol 77, 499-508. Zhong, C., and Schleifenbaum, J. (2019). Genetically Encoded Calcium Indicators: A New Tool in Renal Hypertension Research. Front Med (Lausanne) 6, 128.          
박은총  |  2020.07.29  |  댓글 2
Q. IHC 조직 절편 만들 때 문의 드립니다..
안녕하세요 IHC 관련하여 초보라서 여쭙습니다. 아무리 찾아보아도 답을 찾지 못하여 전문가 분들 조언 구하고자 이렇게 글을 올립니다.    수술 후 검체 (혈관 조직)으로 realtime PCR 및 IHC를 이용한 실험을 계획하고 있습니다.  수술이 시행되는 병원에서부터 실험실까지 거리가 1시간 가량 소요되어, 이동하는 동안에 검체의 변성이 있지는 않을까 하여 검체를 획득하자마자 liquid nitrogen에 검체를 바로 보관하려고 하는데, (RT-PCR 용), 혹시 IHC의 경우에 liquid nitrogen에 보관되어있던 검체를 paraffin block으로 만드는 것은 불가능 한가요? liquid nitrogen에 보관하게 되면 꼭 frozen section으로만 만들어야 될지 여쭙습니다.  그리고 조직에 따라 다르긴 할 것이고, 당연히 실온 보관 시간을 가장 적게 할 수록 정확도가 높기는 하겠지만, 경험적으로 IHC의 경우 formalin fixation을 하기 전에 실온에서 보통 몇시간 정도 까지는 보관 되어도 크게 문제가 없었다거나 하는 사항이 있을지 여쭙습니다..  감사합니다.
회원작성글 tsdr  |  2020.07.29
프로토콜 [연재][후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트] #1_Congenic Mouse
* 본 글은 "BRIC Bio통신원의 연재"에 올려진 동일한 제목의 컨텐츠를 "프로토콜"에서도 소개하기 위해 동일한 내용으로 올렸습니다(클릭시 연재글로 이동).     후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트에서 첫 번째로 다룰 내용은 실험동물로 널리 사용되는 마우스(Mouse)에 대한 내용입니다. 많은 연구자들이 마우스를 이용해 실험을 하지만, 자신이 사용하는 마우스에 대해 제대로 이해하지 못하고 실험을 하는 경우들을 종종 보게 됩니다. 이번에 소개할 내용은 ‘Congenic mouse’에 대한 내용입니다. 해당 개념과 이 마우스가 면역학 실험에서 어떤 방법으로 사용되는지를 소개하는 것이 이 글의 핵심이며, 이 내용들이 면역학 연구를 하고있는 석박사생들에게 도움이 되기를 바랍니다.   1. 들어가는 글: 일란성 쌍둥이를 구분할 수 있는 방법 유전자가 100% 일치하는 일란성 쌍둥이들은 각자의 고유한 습성이나 여러가지 미묘한 차이들이 있지만, 처음 보는 사람들에게는 이들을 서로 구분해내는 것이 여간 쉬운 일만은 아닙니다. 그런데 만약 한 명이 머리에 염색을 하고 있다면, 서로를 구분해내기는 무척 쉬워질 것입니다. 하지만 염색으로 인한 머리색의 변화는 영구적이지 않기 때문에 시간이 지나고 염색된 머리가 사라진다면 둘을 구분하기는 다시 어려워질 것입니다. 이런 문제를 해결하기 위해 머리색에 관여하는 유전자만을 조절해서 한 명의 머리색을 영구적으로 다르게 만든다면 어떨까요? 물론 이런 생각 자체가 어찌보면 현실에서는 우스운 일일 뿐 아니라 가능하지도 않은 일입니다. 그러나 흥미롭게도 우리가 사용하는 실험쥐에서는 이러한 일들이 일어나고 있습니다.     2. Congenic 개념 실험실에서 사용하는 마우스들은 같은 혈통(Strain)끼리 수 많은 세대간의 근친교배(Inbreeding)를 통해 서로간의 유전자가 동일하도록 만든 일종의 Clone들입니다. (비록 깊이 들어가보면 실제로는 100% 일치하지 않지만(Watkins-Chow and Pavan, 2008), 이 글에서 해당 내용은 불필요하다고 여겨져서 다루지 않고 넘어가도록 하겠습니다.) 물론 사람에게서는 일어날 수 없는 않지만, 이들은 부모 자식 형제 할 것 없이 모두가 같은 유전자를 갖습니다. 즉, 태어난 시기만 다를 뿐 이들은 다른 의미에서 모두가 일란성 쌍둥입니다. (쥐의 입장에서 모두가 똑같이 생겼다는 상상을 해보니 무척이나 당혹스럽긴 합니다.) 이처럼 개체간의 유전체가 일치하는 경우를 동계(Syngeneic) 라고 부릅니다. 그러나 실험실에서 널리 사용되는 C57BL/6 마우스와 BALB/c 마우스는 같은 종이지만, 이들의 경우 유전체가 서로 일치하지 않기 때문에 서로에 대해서 동종이형(Allogeneic)이라고 합니다. 동종이형간에는 장기이식을 할 경우 면역 거부 반응이 일어난다는 점에서 서로의 면역체계가 상대를 적으로 인식함을 볼 수 있습니다. 그렇다면 오늘 설명할 내용인 Congenic이란 무엇일까요? Syngeneic의 경우에서 하나의 유전자만이 (정확히는 유전 인근의 유전체 덩어리: linked segment) 차이 나는 경우를 congenic이라고 부릅니다. 앞서 들어가는 글에서 예시를 든 머리색을 결정짓는 유전자만이 다른 쌍둥이라고 생각한다면 이해하기 쉬울 것입니다 (그림 1).   3. Congenic mouse 만드는 방법 어떻게 하면 내가 원하는 유전자에서만 차이를 갖는 Congenic 마우스를 만들 수 있을까요? 그 실제적인 과정은 매우 길고 어렵지만, 답은 간단합니다. 우선 내가 원하는 유전자를 갖고있는 마우스와 (공여자: Donor) 내가 필요로 하는 유전적 배경을 갖는 Strain의 마우스 (수여자: Recipient) 를 교배하여 원하는 유전자와 그에 따른 형질이 유입된 마우스를 선별적으로 얻어냅니다. 그 다음에 해당 마우스와 수여자 마우스간의 여러 세대를 거친 Backcrossing을 통해 원하는 유전자만이 선택되어 남고 원하지 않는 공여자의 유전자는 희석되어 사라지도록 만드는 것입니다 (그림 2). 이론적으로는 10회에 걸친 교배를 통해 본래 필요로 하는 수여자의 유전적 배경을 99.9% 회수할 수 있습니다 (1-1/210 = 0.999). 하지만 동물실에서 원하는 마우스를 얻기 위해 오랜 시간 기다려본 대학원생이라면 이 과정이 말처럼 쉽지만은 않다는 것을 알 것입니다.   본래 Congenic 마우스를 만드는 목적은 원하는 유전자만을 바꿔치기 하는 (전문적인 용어로는 변이) 것입니다. 하지만 정말 의도된 유전자를 제외한 나머지 유전자는 모두 수여자의 유전자일까요? 어디까지나 그렇다고 가정을 하는 것일 뿐, 실제로는 그렇지 않습니다. 여전히 일부 유전자는 공여자로부터 오게 됩니다(Schalkwyk et al., 2007). 그렇기 때문에 Congenic 마우스를 통해 실험을 할 때는 내가 얻은 결과가 혹시 다른 의도되지 않은 유전자의 변이 때문은 아닌지 생각해볼 필요가 있습니다.   4. Congenic 마우스의 사용례: CD45 congenic mouse (B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyJ) 이러한 Congenic 마우스는 어떤 목적으로 사용할 수 있을까요? Congenic 마우스는 변이시킨 유전자에 따라 매우 다양한 방법으로 응용하여 사용할 수 있습니다. 모든 것을 다 설명할 수는 없기에 면역학 실험에서 많이 사용하는 Congenic 마우스를 한가지 소개하려 합니다. CD45라는 단백질은 모든 면역세포가 공통적으로 세포 표면에 발현하는 단백질입니다. 흥미롭게도 마우스에서 CD45를 발현하는 유전자는 Ptprca와 Ptprcb라는 두 가지 대립유전자(Allele)가 존재하며, 이 두 대립유전자에 의해 발현되는 CD45 단백질은 각각 CD45.1과 CD45.2로 불립니다. 일반적으로 널리 사용되는 C57BL/6 마우스를 포함한 대부분의 마우스에서는 CD45.2가 발현되지만, SJL 마우스에서는 CD45.1이 발현됩니다. 이 두 단백질은 기능상의 차이는 없다고 알려져 있으며, 세포 표면에 노출되는 부분에서 다섯 개의 아미노산 서열 차이를 보일 뿐입니다(Zebedee et al., 1991). 흥미롭게도 이 다섯 개의 아미노산 서열 차이에 의한 구조적 변화는 서로 다른 단일클론항체(Monoclonal antibody)에 의해 구별될 수 있습니다. 연구자들은 CD45 단백질이 갖는 이러한 성질을 연구에 활용하기 위해서 앞서 설명했던 교배전략을 이용해 CD45.2대신 CD45.1을 발현하는 C57BL/6 배경의 Congenic 마우스를 만들었습니다. 그렇다면 CD45 Congenic 마우스는 면역학 연구에 어떻게 활용할 수 있을까요? 가장 대표적으로 활용되는 것은 Adoptive transfer를 통한 in vivo tracking입니다 (그림 3).   면역세포들은 다른 일반적인 세포들과 구별되는 여러가지 특징들이 있습니다. 먼저 한 자리에 머무르기보다는 계속해서 이동한다는 특징이 있습니다. 면역세포의 시기적절한 이동은 외부 병원균에 의한 감염에 저항하기 위해서는 필수적인 요소입니다. 반대로 지나친 면역세포의 조직내 침윤(infiltration)은 오히려 과도한 염증반응을 유발하고 자가면역질환을 일으키는데 일조하기도 합니다. A라는 유전자를 연구하고 있고, 이 유전자는 염증이 일어나고있는 조직으로의  면역세포이동에 관여한다고 가정을 해보도록 하겠습니다. 가장 확실하게 A라는 유전자가 면역세포의 이동에 관여함을 보여줄 수 있는 방법은 A 유전자가 제거된 면역세포와 Wild type (WT) 면역세포를 “동일한 환경의 하나의 체내에서 (in vivo)” 경쟁시켜보는 것일겁니다. 이러한 경쟁을 위해서는 A 유전자가 제거된 Knock out (KO) 마우스와 WT 마우스에서 각각 연구하는 세포를 얻어낸 뒤 제 3의 수여자(recipient) 마우스에 넣어주는 과정이 필요합니다 (Adoptive transfer). 하지만 이미 몸속으로 들어간 세포가 어디에서 왔는지 알기 위해서는 각각의 세포를 표시할 수 있는 방법이 필요합니다. 이러한 목적을 위해 CD45.1과 CD45.2를 발현하는 면역세포를 다음과 같이 활용할 수 있습니다. 우선은 WT 면역세포를 CD45.2를 발현하는 C57BL/6 마우스에서 얻어내고, 추가적인 교배를 통해 A 유전자 KO 면역세포는 CD45.2와 CD45.1을 공동 발현하는 마우스(Heterozygous)에서 얻어냅니다. 그 이후에 같은 숫자의 세포를 CD45.1을 발현하는 마우스(Recipient)에 넣어주고(Adoptive transfer) 염증반응을 유도하면 면역세포들이 조직으로 이동하게 됩니다. 이후에 CD45 발현을 통해 어떤 세포가 조직으로 더 많이 이동했는지를 확인할 수 있습니다. (CD45는 세포표면에 발현되는 분자이기 때문에 Flow cytometry라는 기법을 활용해 쉽게 확인할 수 있습니다.) 면역세포가 갖는 많은 특징들 중에 또 하나 흥미로운 점은 특정 신호에 반응해서 최종적인 기능을 갖는 다양한 세포로 분화한다는 점입니다. 저는 CD4 T cell을 연구하고 있는데, CD4 T cell은 Th1, Th2, Th17, Treg 등등 다양한 Helper T cell subset으로 분화가 이루어집니다. 그리고 이러한 분화에 영향을 주는 요인들은 Cell intrinsic factor와 Cell extrinsic factor로 크게 나눌 수 있을 것입니다. 연구하고 있는 B라는 유전자가 없는 마우스에서 CD4 T cell의 분화 차이가 발견됐다고 가정해보겠습니다. 이 경우 B 유전자의 손실이 다른 세포에 영향을 주고, 이로 인해 생기는 외부적요인의 변화가 (Cell extrinsic factor) CD4 T cell 분화에 영향을 준 것일 수 있습니다. 혹은 CD4 T cell 자체 내부에서 (Cell intrinsic factor) B 유전자의 기능이 필요한 것일 수도 있습니다. 이러한 가능성을 확인하는 방법에도 Congenic 마우스를 활용할 수 있습니다. 서로 다른 CD45 congenic marker를 발현하는 마우스에서 얻은 WT과 KO 면역세포를 공동 수여자에게 넣어준 뒤 분화정도를 비교하는 것이 그 활용방안입니다. 만약 이러한 경우에 WT과 KO CD4 T cell간의 분화차이가 사라진다면, B 유전자 KO 마우스가 보였던 형질은 Cell extrinsic factor에 의한 현상이라고 볼 수 있을 것입니다. 반대로 두 세포가 같은 환경에 있음에도 분화의 차이가 발견된다면, B 유전자가 CD4 T cell 분화에서 Cell intrinsic factor로 작용함을 추가적으로 증명할 수 있게 됩니다. 이 외에도 방사선처리를 한 수여자에게 서로 다른 Congenic marker를 갖는 마우스에게서 얻은 골수를 이식하면, 한 몸에서 WT과 KO세포 모두를 갖는 Chimera mouse를 만드는 것도 가능합니다.   5. Congenic 마우스를 활용한 연구에서 유의할 부분 이론적으로 Congenic 마우스는 최초에 의도한 유전자에서만 차이를 가져야합니다. 하지만 실제로는 그렇지가 않다는 것을 간과해서는 안 됩니다. CD45 congenic 마우스와 C57BL/6를 비교한 한 연구에 따르면 최소 45개의 유전자에서 124개의 SNP가 발견되었습니다(Waterstrat et al., 2010). 또한 Congenic 마우스로 예상치 못하게 유입된 유전자의 변이가 Cytomegalovirus 감영에 대한 저항성 차이를 나타내기도 합니다(Jang et al., 2018). 이러한 사실로 미루어 볼 때, Congenic 마우스를 사용한 연구에서 발견된 형질의 차이가 내가 연구하는 유전자가 아닌 제 3의 유전자에 의해 생긴 것일 가능성도 완전히 배제하기란 어렵습니다. 만약 이런 일이 벌어진다면, 이것은 매우 흥미로운 연구가 될 수도 있지만, 반대로 그동안 진행해온 프로젝트의 방향을 잃어버리는 안타까운 일이 될 수도 있기 때문에 Congenic 마우스에 대한 바른 이해와 적용이 필요합니다. 이러한 C57BL/6 마우스와 CD45 congenic 마우스간에 의도치 못하게 생긴 변이의 가능성을 조금이라도 배제하고자, 저는 한 그룹은 CD45.2를 발현하고 (C57BL/6) 다른 한 그룹은 CD45.2와 CD45.1을 모두 발현하도록 (C57BL/6와 CD45 congenic mouse의 교배를 통해 얻은 그룹) 실험을 설계합니다.   6. 마치는 글 Congenic 마우스라는 개념은 이미 오래전에 확립된 개념이지만, 면역학 연구에서 세포의 이동, 분화 등등을 연구하기 위해 아직도 사용되는 고전적인 연구방법 중 하나입니다. 처음 대학원에 들어와서 저널 발표를 준비하던 때 골랐던 논문에 나온 이 개념이 제겐 너무나 생소해서 이것을 이해하는데 상당한 시간을 할애했던 기억이 납니다. 실험용 마우스는 매력적인 실험동물입니다. 다양한 마우스 Strain에 대한 이해는 MHC 분자가 면역거부반응을 결정짓는 중요한 인자라는 사실을 발견하게 했습니다(McDevitt and Chinitz, 1969; Zinkernagel and Doherty, 1974). 또한 이전에는 상상도 못했던 Conditional Knock-out 마우스는 이제 더이상 놀라운 기술이라 느껴지지 않을만큼 보편화 되어서 유전자의 기능연구를 가속화하고 있습니다. 이처럼 마우스를 활용한 연구는 계속해서 발전해나갈 것입니다. 마우스를 이용해서 연구를 하고있는 대학원생들이 저의 글을 통해 마우스에 대한 이해도가 조금이라도 확장되었기를 바라며 이번 글을 마무리 짓겠습니다.   참고문헌 - Jang, Y., Gerbec, Z.J., Won, T., Choi, B., Podsiad, A., B, B.M., Malarkannan, S., and Laouar, Y. (2018). Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. J Immunol 200, 1982-1987. - McDevitt, H.O., and Chinitz, A. (1969). Genetic control of the antibody response: relationship between immune response and histocompatibility (H-2) type. Science 163, 1207-1208. - Schalkwyk, L.C., Fernandes, C., Nash, M.W., Kurrikoff, K., Vasar, E., and Koks, S. (2007). Interpretation of knockout experiments: the congenic footprint. Genes Brain Behav 6, 299-303. - Waterstrat, A., Liang, Y., Swiderski, C.F., Shelton, B.J., and Van Zant, G. (2010). Congenic interval of CD45/Ly-5 congenic mice contains multiple genes that may influence hematopoietic stem cell engraftment. Blood 115, 408-417. - Watkins-Chow, D.E., and Pavan, W.J. (2008). Genomic copy number and expression variation within the C57BL/6J inbred mouse strain. Genome Res 18, 60-66. - Zebedee, S.L., Barritt, D.S., and Raschke, W.C. (1991). Comparison of mouse Ly5a and Ly5b leucocyte common antigen alleles. Dev Immunol 1, 243-254. - Zinkernagel, R.M., and Doherty, P.C. (1974). Immunological surveillance against altered self components by sensitised T lymphocytes in lymphocytic choriomeningitis. Nature 251, 547-548.          
박은총  |  2020.07.22
Q. NO production assay 가 안나옵니다.ㅠㅠ
안녕하세요 NO production assay로 인해 큰 어려움을 겪고 있는 석사과정생입니다.  다름이 아니라 잘 나오던 NO Production이 안나오니까 미치겟네요... Intron 사의 NO Production kit 를 쓰고 있습니다. 실험 조건은 다음과 같습니다.   12 well 에 Raw 264.7 세포를 2x10^4/ml 분주하고 24시간 안정화 시킨뒤 H37Rv로 (결핵균)  10 MOI 를 감염시킨뒤 4시간후에 PBS로 2번 Washing하여 extracellular bacteria를 제거 합니다 이후 약물을 처리한 후 18 hr 24 hr 48 hr 뒤에 상층액을 얻어서 12000 rpm 5 min  centrifuging 후 상층액만을 얻자마자 96 well에  100ul씩 처리하여  이후 data sheet 에 나와있는대로 no 생성량을 확인하는데.. 모든 그룹에서 배지가 (DMEM 10% FBS no P/S) 노란색을 변하고 분홍생 발색이 안됩니다. 스탠다드는 잘 잡히는데 샘플에서 NO 발생이 안되는 것 같아서 트러블 슈팅으로 5X10^4/ml 로 세포 양도 늘려보고 혹시나 해서 상층액을 3/1로 희석도 해봣는데.. 모든게 안잡히네요...........하...... 어떤 문제인지 조언 부탁드립니다. a미칠 것 같습니다...ㅠㅠ
회원작성글 목성인이다  |  2020.07.17
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